肉桂醛对脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织自噬的影响

周佳明 浦延鹏

1)葫芦岛市中心医院，辽宁 葫芦岛 125003 2)锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000

脑卒中是困扰全世界的疾病之一，近年来因脑卒中死亡的人数已上升到致死性疾病的首位，同时其也是造成病人残疾的第一大致病原因[1]，缺血性脑卒中发病率约占77.8%，且治疗方法有限[2]，大多以溶栓、抗凝等为主，很多西药都具有不同的时效性及不良反应，相比较而言，中医中药在脑卒中的治疗上，因临床效果显著，无不良反应等特点，而被绝大多数患者认可，广泛应用于临床。大脑组织在缺血再灌注后很容易发生损伤，已有相关文献表明[3-6]这种损伤多与线粒体功能障碍、炎症反应及神经元细胞的自噬与凋亡、BBB的渗透性等有关。LEE 等[7]通过实验研究发现，在大鼠脑缺血性损伤后，给予肉桂的提取物治疗后，能明显减少脑梗死的面积，改善神经细胞的损伤，所以如何有效改善脑缺血再灌注后的组织损伤成为了治疗的突破口，也是众多学者们研究的热点内容，而“自噬”在则此种脑组织损伤过程中，扮演了重要的角色，它对于脑缺血再灌注后神经细胞的“生存”与“灭亡”影响甚重，有相关文献报道指出[8]，中药单体及复方能有效减小组织缺血再灌注后坏死的面积，并能够改善相应脏器的功能障碍，其治疗机制可能与自噬作用的调控有关。祖国传统医学针对于脑梗死疾病治疗的中药药物种类有很多，其中的桂枝、肉桂也是治疗脑梗死的常用药，主要取其温经通脉的功用，其中桂枝气薄，走而不守，温通之力强，可解表散寒、化瘀通痹；而肉桂气厚，守而不走，温补之力强，善温补脾肾，温阳通痹；而肉桂醛[9-10](CA)(桂皮醛)就是从桂皮中提取的天然产物，CA的性状呈黄色黏性液体，是樟科植物肉桂挥发油的主要成分，肉桂醛作为一种天然活性成分，具有降血糖、抗病毒和解热镇痛等多种药理作用，常用于作治疗血液循环障碍类疾病，疼痛及消化不良等方面[11-14]；此外因其还具有抗氧化和抗炎的特性，所以不少学者将其用于改善大鼠心、脑、肾等脏器的缺血性再灌注损伤的治疗，BAE等[15]通过动物实验发现，肉桂醛对MPTP诱导的PD小鼠模型具有神经保护作用，其作用机制可能是通过抑制神经元的死亡及细胞自噬，并且与下调P62蛋白的表达有关。而本研究主要针对大鼠脑缺血再灌注损伤机制的探析，针对肉桂醛的具体作用机制是否与自噬相关，尚未有相关文献详细报道，于是此次研究将通过中药单体肉桂醛干预治疗大鼠脑缺血再灌注损伤，观察其对大鼠脑组织血流量和自噬作用的影响，探析其对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的作用机制。

1 材料与方法

1．1实验动物及分组选择SPF级健康成年的雄性SD大鼠50只，体质量为(280±20)g，购买于锦州医科大学动物实验中心(许可证编号：SCXK[辽]2014-0004)。购入后适应性饲养7 d时间，动物室温度保持在(20±2)℃，湿度保持在45%左右，每12 h昼夜交替，给予大鼠自由饮水，常规颗粒饲料喂养，每2～3 d更换1次垫料。采用随机数字表法将50只SD大鼠随机分成假手术组、模型组、肉桂醛高剂量组、3-MA组、肉桂醛低剂量组，每组各10只。实验过程中对动物的处理均遵照科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中相关动物的实验使用及伦理学规定。

1．2主要试剂与仪器组织自动脱水机、石蜡包埋机、生物组织摊烤片机(武汉俊杰电子有限公司)，石蜡切片机(莱卡显微系统(上海)有限公司)，显微镜(尼康仪器有限公司，日本)，电泳仪及发光成像系统(Bio-Rad)，激光多普勒血流仪(moor，英国)，电热恒温鼓风干燥(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司)。SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒、BCA蛋白质定量试剂盒、超敏ECL试剂盒、β-actin抗体、HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)、beclin-1(万类生物)，LC3II抗体、p62抗体(proteintech公司)，3-Methyladenine (3-MA，T1897，50mg)购自Targetmol公司；二甲苯、无水乙醇(西陇科学股份有限公司)，甲酚紫(索莱宝)，冰醋酸(西亚试剂)。

1．3模型制备方法采用改良线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。将SD大鼠麻醉后，用橡皮筋绑住四肢，仰卧位固定于木板自制的手术台，分离右侧颈总动脉、颈内动脉，于远心端将颈内动脉剪个“V”型口，将磨圆滑的鱼线插入2 cm，然后将鱼线和颈内动脉一起结扎。1.5 h后将鱼线拔出，缝合皮肤。待大鼠清醒后对其进行神经功能缺损程度的评分，参照Longa 5分制评分标准[16]进行评分，将评分为1～3分的大鼠纳入实验，未达标者排除。实验过程中2只大鼠死亡，随机补充。假手术组术式同上，但鱼线插入深度为0.5～1 cm。

1．4干预方法肉桂醛组大鼠分别给予腹腔注射肉桂醛75 mg/(kg·d)和25 mg/(kg·d)治疗，根据相关的实验研究选择肉桂醛的治疗剂量[17]，3-MA组：于造模前1 h腹腔注射3-MA(10 mg/kg)，造模成功后与假手术组和模型组一起，每天腹腔注射与高剂量肉桂醛组相同剂量的生理盐水，共治疗7 d。

1．5指标测定

1．5．1 各组大鼠治疗前后神经缺损评分变化：参照LONGA等[16]评价方法，对各组大鼠在治疗前后分别行神经功能缺损评分，并作比较。

1．5．2 大鼠脑血流速度检测：治疗7 d后，用一次性注射器将20%乌拉坦(5 mL/kg)，由腹腔注入，以麻醉大鼠，然后将其固定在ST-3ND型定位仪上，暴露出颅骨冠状缝和矢状缝，取冠状缝下3 cm，矢状缝右旁开2 cm处骨钻，打开硬质骨及硬脑膜，暴露软脑膜，开颅出直径约1 cm的“窗口”。将激光多普勒血流仪探针头固定在支架上，让探头以均等力度接触到软脑膜上，然后用计算机连续记录血流量及血流速度。

1．5．3 尼氏染色：于治疗干预7 d后，各组随机抽取3只大鼠腹腔麻醉，迅速断头取脑置于4%多聚甲醛中固定，经脱水、石蜡包埋后进行切片，然后用1%焦油紫或1%硫堇染色1 h。蒸馏水清洗，70%酒精分色数秒至数分钟，依次经70%酒精、80%酒精、95%酒精，各2 min脱水，无水乙醇2次，每次5 min。二甲苯2次，每次10 min，然后脱水透明封片，用拍照显微镜对大鼠左侧大脑皮质缺血区进行拍照观察计数，尼氏体呈紫色、细胞核呈淡紫色。

1．5．4 Western blot法检测大鼠脑组织自噬相关蛋白Beclin1、LC3II、P62的表达：在各组大鼠再灌注7 d后，随机选取3只腹腔麻醉，迅速断头取脑，取皮层缺血区脑组织制备蛋白样本，用BCA法检定量各样本组蛋白，采用12%的SDS-PAGE凝胶，取30 μg蛋白样品，电泳后采用0.22 μm的PVDF膜进行蛋白转印，电泳及转膜系统购自Bio-Rad。5%脱脂奶粉室温封闭2 h后一抗(1∶500)于4 ℃摇床里孵育过夜，用TBST洗膜3次(10 min/次)后将PVDF膜封入二抗稀释液(1∶2 000)中，室温摇床孵育2 h，再用TBST洗膜3次(10 min/次)后在PVDF膜上滴加ECL显影液，以化学发光成像系统(Bio-Rad，USA)曝光成像，上述实验重复3次，以β-actin作为内参，用Image J软件进行灰度值分析。

2 结果

2．1各组大鼠神经功能评分比较假手术组大鼠未出现神经功能障碍的表现，而模型组大鼠则出现不同的神经功能障碍。7 d后，统计结果发现，与模型组比较，肉桂醛高剂量组大鼠神经功能缺损评分下降明显，抑制剂组评分亦下降，各组差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01Figure 1 Comparison of neurological deficit scores of rats in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

2．2各组大鼠脑组织血流的变化各组大鼠7 d后大脑皮质组织血流量变化如图2所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑血流量明显减少(P<0.01)；与模型组比较：肉桂醛高剂量组和3-MA组血流量及速度均明显增加(P<0.01)。

图2 各组大鼠脑缺血再灌注后7 d大脑皮质血流量的影响及速度 与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01Figure 2 The influence and velocity of cerebral cortex blood flow 7 days after cerebral ischemia reperfusion in each group of rats．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

2．3各组大鼠缺血侧大脑皮质尼氏染色比较尼氏小体是神经元体内嗜碱性颗粒，当神经元功能正常时，其结构较固定，当神经元受损时，尼氏小体会减少甚至溶解，因此可通过尼氏染色观察尼氏小体的状态判断脑组织缺血侧神经损伤的情况，通过镜下观察发现假手术组缺血侧大脑皮质神经元细胞尼氏小体(呈紫色、细胞核呈淡紫色)结构完整，细胞呈多角形，模型组可见尼氏小体数量减少，肉桂醛高剂量组和3-MA组尼氏小体的数量较模型组多(P<0.01)。见图3、4。

注：1(假手术)、2(模型组)、3(肉桂醛高剂量组)、4(3-MA组)、5(肉桂醛低剂量组)×200倍镜下拍照，标尺=100 μm

2．4各组大鼠缺血侧脑组织自噬相关蛋白beclin1、LC3II、P62的表达与假手术组相比，模型组beclin1和LC3II蛋白表达水平升高，而p62表达水平降低(**P<0.05)，与模型组比较，肉桂醛高剂量组和3-MA组beclin1、LC3II蛋白表达水平明显减少，而p62的表达水平明显增多(##P<0.05)。

图4 各组尼氏体数量比较 与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01Figure 4 Comparison of the number of Nissl bodies in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

图5 各组大鼠脑组织自噬相关蛋白的表达与假手术比较，**P<0.05；与模型组比较，##P<0.05Figure 5 The expression of autophagy-related proteins in the brain tissue of rats in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

3 讨论

随着时代的发展，生活水平的不断提高，人们不良的生活及饮食习惯亦日渐增多，与此同时，如高血脂、高血压、糖尿病等代谢性疾病的发病亦呈增高的趋势，由此类基础疾病所导致的患者脑梗死发病率也逐年升高，严重威胁人类的健康，又因该病具有高致残率和病死率的特点，遂被专家、学者们持续的关注和研究[17-18]。近期有相关文献研究发现[19]，脑缺血再灌注所致的神经功能损伤及细胞凋亡与自噬密切相关，当发生脑缺血再灌注损伤后，机体会发动自噬作用来清除受损的细胞器，以发挥脑保护作用；因自噬作用是一种自我降解和清除的动态过程，当机体受到外界的刺激导致细胞器受损时，就会激活自噬作用以降解受损细胞器和清除蛋白质[20]。据相关文献报道称中药可以抑制神经元的过度自噬而改善缺血再灌注后相应脏器功能的恢复[10]，而“自噬”作为脑缺血再灌注损伤中重要的病理变化之一，现已经成为学者们探究的热点内容[21-22]，自噬主要分为三大类型：微自噬、巨自噬、分子伴侣介导的自噬，而巨自噬就是通常所说的“自噬”，主要过程为诱导自噬、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合及内容物降解。在整个自噬作用的过程中，LC3II是生成自噬体膜的必备物质，是自噬体形成的最重要分子[23]；而P62作为自噬底物蛋白，凭借在C端与泛素化蛋白结合，和在N端与LC3-Ⅱ相结合，参与整个自噬的降解[24]。因此，我们选用LC3II和P62两个指标的表达来反映自噬作用。此外在自噬体形成的初始阶段，Beclin1与Ⅲ型PI3K、p150结合形成Ⅲ型PI3K复合体，作为该复合物的中心蛋白，主要发挥促使自噬体成熟的作用[25]，然后Beclin1还能与Atg1及Atg9一同作用，共同参与调控吞噬泡的形成，最终促进自噬的发生[26]，所以本次研究选择检测LC3II、Beclin1和P62的表达来指示自噬通量。而3-MA则是针对自噬作用常用的一种抑制剂，广泛用于自噬诱导的研究中，因此我们选用3-MA作为阳性对照，来比较和探究肉桂醛对脑缺血再灌注损伤的大鼠脑组织的保护作用是否与自噬作用相关。

本次研究主要观察肉桂醛对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的治疗作用，通过药物治疗干预后，分析大鼠神经功能评分、脑血流的改变以及脑组织尼氏染色和自噬相关蛋白的表达，最终得出这样的结果，大鼠脑缺血再灌注损伤在肉桂醛进行治疗干预后，大鼠的神经功能得到明显改善，于此同时与模型组比较，自噬相关蛋白Beclin1、LC3II蛋白表达水平明显减少，而P62的表达水平明显增多，说明自噬作用被抑制，由此可以得出这样的推论，肉桂醛能够改善脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的神经功能，且高剂量组效果最为显著，其具体的作用机制可能是通过抑制自噬作用而发挥疗效的。