二氢姜黄素体外处理BRL-3A细胞对细胞凋亡通路的影响*

吴 刚，陈训军，张万里，李 芬

姜黄素是一种多酚类化合物，可从天南星科和姜科植物的根茎中分离得到，具有多种药理学活性，包括保护肝脏、降脂、抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用等，还可以通过修复线粒体功能改善(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)病变[1-3]。二氢姜黄素(dihydrocurcumin，DHC)是姜黄素代谢得到的产物之一。关于DHC的药理学活性研究还较少，可能具有改善NASH动物肝脏脂肪沉积和胰岛素抵抗作用，还可能有抗氧化和抗炎作用。 本研究观察了DHC对棕榈酸(palmitic acid，PA)体外诱导的正常大鼠肝细胞系BRL-3A细胞脂肪变的影响，了解其在改善线粒体介导的凋亡通路方面的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞、药品、试剂与仪器 正常大鼠肝细胞系BRL-3A细胞购自武汉大学菌种保藏中心，由本实验室保存。DHC单体(上海源叶生物公司，纯度≥98%)；PA和MTT(Sigma公司)；DMEM高糖培养基(Gibco公司)；胎牛血清(四季清生物公司)；胰酶(吉诺生物公司)；检测LDH试剂盒(南京建成生物公司)；检测Caspase-3和Caspase-9试剂盒、RIPA裂解液、SDS上样缓冲液和化学发光液(碧云天生物公司)；检测Annexin V-PI凋亡试剂盒(KeyGen公司)；抗β-actin、抗Bcl-2和抗Bax(Santa生物公司)；BCA试剂盒(Thermo公司)；Cocktail(Roche生物公司)。XDS-1B倒置相差显微镜(佳源兴业科技有限公司)；iMARKTM酶标仪(BIO-RAD公司)；台式低温高速离心机(Eppendorf公司)；-80℃超低温冰箱(海尔电器有限公司)；超净工作台(安泰空气技术有限公司)；HEAR Cell CO2培养箱(Heraeus公司)；电泳仪、垂直电泳槽、电转仪(六一仪器厂)；Imager2000凝胶成像分析仪(Alpha Innotech公司)。

1.2 细胞培养与分组处理 取BRL-3A细胞，接种于6孔板，培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，37℃、5%CO2培养。设对照组，用正常培养基培养；模型组，用0.25 mM PA培养24 h和DHC处理组，先用0.25 mM PA培养24 h，再换成含16、32和64 μM DHC的培养基培养24 h。

1.3 细胞存活率检测 将生长良好的细胞按每孔1×103个细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后，加入0.25 mM PA培养24 h。然后，分别加入0、2、4、8、16、32、64和128 μM的DHC处理24 h。处理完成后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl 和PBS 180μl，于37℃反应4 h，再每孔加入DMSO 150 μl，震荡6 min，检测570 nm处的吸光值。

1.4 细胞培养上清LDH含量检测 取细胞1×105个，接种于6孔板。如上处理，每孔吸取上清液20μl，按试剂说明书操作，检测490 nm处吸光值。收集孔中细胞并裂解，检测蛋白浓度，计算每mg蛋白中LDH 含量。

1.5 细胞凋亡检测 接种细胞1×105个于6孔板，同上处理后，消化并收集细胞。按Annexin V-PI凋亡试剂盒说明行染色和冲洗，使用流式细胞仪检测坏死、早期凋亡和晚期凋亡细胞数。

1.6 细胞线粒体膜电位检测 取细胞1×105个，接种于6孔板，处理完成后用PBS洗涤，每孔加入5 μg/ml 的荧光染料JC-1 1 ml，37℃反应20 min，分别检测激发波长525 nm/发射波长590 nm处和激发波长490 nm/发射波长530 nm处的荧光强度，其比值即为样本的线粒体膜电位。

1.7 细胞内Caspase-3和Caspase-9活性检测 取细胞1×105个，接种于6孔板，处理完成后消化并收集细胞，检测蛋白浓度，计算每mg蛋白中Caspase-3和Caspase-9的相对活性。

1.8 细胞Bcl-2和Bax蛋白表达检测 采用Western blotting法检测，取细胞1×105个，接种于6孔板，处理完成后消化并收集细胞，用含有Cocktail和PMSF的RIPA裂解液在冰上处理细胞30 min，将得到的液体在12000 g离心10 min，取上清，获得所需的蛋白液。按50 μg，分装，并100℃变性10 min。用SDS-PAGE胶分离蛋白，电转至PVDF膜上，封闭1 h，分别与特异性的一抗和二抗各孵育1 h，经化学发光液显色，用成像仪分析结果。

2 结果

2.1 各组细胞存活率比较 0.25 mM PA及2、4、8、16、32和64 μM的DHC处理BRL-3A细胞24 h对细胞存活率无显著影响，但128 μM的DHC处理细胞24 h能显著抑制细胞生长，细胞存活率约为模型组的78%(P<0.05)。因此，我们选择16、32和64 μM的DHC进行后续实验。

2.2 各组细胞上清液生化指标比较 与对照组比较，模型组LDH水平、胞内Caspase-3和Caspase-9活性显著升高(P<0.01)，线粒体膜电位显著降低(P<0.01)；与模型组比较，32μM DHC处理组和64μM DHC处理组LDH水平、胞内Caspase-3和Caspase-9活性明显降低(P<0.05)，线粒体膜电位明显升高(P<0.05，表1)。

表1 DHC和PA处理的细胞上清液生化指标比较

2.3 各组细胞凋亡情况比较 与对照组比，模型组凋亡细胞率明显增加；与模型组比，PA处理组凋亡细胞率明显降低(图1)

图1 各组细胞凋亡率比较

2.4 各组细胞Bcl-2和Bax蛋白表达量比较 与对照组比，模型组Bcl-2蛋白相对表达量降低(P<0.05)，Bax蛋白相对表达量升高(P<0.05)；与模型组比，32μM DHC处理组和64μM DHC处理组Bcl-2蛋白相对表达量升高(P<0.05)，Bax蛋白相对表达量降低(P<0.05，表2和图2)。

表2 各组细胞Bcl-2和Bax蛋白相对表达量比较

图2 各组BRL-3A细胞Bcl-2和Bax蛋白表达量比较

3 讨论

关于NASH的流行病学研究表明，NASH患者的发病率逐年在增加，在未来十年可能成为肝移植的主要原因。因此，关于NASH的防治研究已成为研究的热点。细胞凋亡与有丝分裂的过程在正常情况下处于平衡状态，维持机体细胞的平衡。但在NASH模型中凋亡占主导地位，凋亡过度会进一步导致肝损伤和氧化应激紊乱等。因此，能否改善肝细胞的凋亡对于NASH的治疗具有重要意义。用脂肪酸刺激肝细胞建立NASH的体外模型较为成熟，为研究药物对NASH的作用机制奠定了良好的基础。

在PA诱导的BRL-3A细胞，我们首先观察到DHC对PA引起细胞LDH的释放有缓解作用。LDH一般存在于细胞质中，当细胞膜受损的时候会被释放到培养上清，因此培养上清LDH越多，代表细胞膜受损越严重[11]。我们的结果显示DHC可以减少细胞LDH的释放，说明DHC可以改善PA引起的细胞膜的损伤。然后，我们用流式细胞仪检测了凋亡细胞情况，结果发现DHC可以减少由PA引起的细胞早期凋亡、晚期凋亡和坏死数量。通过这部分的研究结果，我们推测DHC可以改善脂肪变情况下的细胞凋亡。

在细胞凋亡的过程中，线粒体介导的通路是非常重要的机制之一。线粒体凋亡途径的激活主要与过多的ROS以及氧化损伤相关，它们会破坏线粒体膜的通透性，妨碍线粒体呼吸链的功能，形成凋亡复合物，活化凋亡效应蛋白，加剧肝细胞的凋亡，导致肝损伤。而NASH与线粒体功能紊乱也关系十分密切。因此，我们推测DHC是否可以通过改善NASH模型线粒体介导的凋亡通路来减少细胞凋亡。

为了验证我们的猜想，我们首先检测了细胞线粒体膜电位的改变，结果显示PA会显著降低细胞线粒体的膜电位，DHC可以恢复线粒体的膜电位。线粒体的膜电位被消除，是线粒体介导的凋亡通路被激活的标志，它会导致线粒体内外膜之间的一些通道开放，引发后续凋亡事件的发生[14, 15]。这部分结果说明PA确实会激活线粒体的凋亡通路，而DHC可以抑制该通路。

Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，通过保持线粒体膜的完整性来对抗凋亡[16]。Bax是促凋亡蛋白，可以形成Bax孔道，破坏线粒体外膜的通透性，使凋亡因子释放出来[17]。Caspase-3和Caspase-9是线粒体介导的凋亡途径中的效应蛋白分子，它们一旦发生活化，会引起细胞DNA的断裂、细胞核膜的裂解、核内染色质凝聚等，导致细胞凋亡[18, 19]。我们检测了PA和DHC对这两个酶活性的影响，结果发现PA会显著性地增加这两个效应酶的活性，促进细胞凋亡的过程，而DHC可以降低这两个酶的活性，抑制细胞凋亡。