黄芪对小鼠心脑血管系统代谢稳态的影响

邓小颖，杨旭萍，刘佩芳，张尊建*，黄 寅**

（1中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，南京210009；2哈尔滨医科大学附属第二医院神经内科，哈尔滨150086）

黄芪为豆科植物膜荚黄芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.］或蒙古黄芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var.mongholicus（Bge.）］的干燥根，首载于《神农本草经》，药用历史已有2000多年［1］；2015 版《中华人民共和国药典》一部中收载的含黄芪中药制剂多达163 个［2］。中医认为黄芪味甘，性微温，具有益气养元、养心通脉、祛邪扶正等功效。临床实践中，黄芪饮片、提取物及复方制剂被广泛用于治疗冠心病、心力衰竭、动脉粥样硬化、脑梗死等心脑血管疾病［3-4］。现代药理学研究表明［5-8］，黄芪通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）促进心肌细胞脂肪酸β 氧化，提高心脏能量供应，改善心力衰竭；可上调葡萄糖转运体4（GLUT4）及与葡萄糖代谢相关酶的表达改善2型糖尿病的糖耐量受损症状；可降低胆固醇合成关键酶HMG-CoA 的表达抑制胆固醇的合成缓解高脂血症的症状；可抑制β-分泌酶（BACE1）活性，降低β-淀粉样多肽在阿尔茨海默病脑中的蓄积。目前，关于黄芪“修心护脑”作用的研究大多从分子药理学角度开展，聚焦于一些经典的信号通路，而对黄芪作用后机体循环血液及心脑等靶器官的代谢应答情况则鲜有研究。

代谢组学是一门利用现代分析技术，研究生物体受环境、疾病、药物等因素影响后内源性代谢物数量、种类及其变化规律的新兴学科［9］。中药多成分、多途径、多靶点的特点给中药现代化研究带来了巨大挑战，而代谢组学的系统生物学特点与中药的整体观相符合，为中药现代化研究提供了方向性新手段［10］。目前，代谢组学已在中药药效物质基础与作用机制、中药复方研究及中药安全性评价等方面得到了广泛运用［11-12］。本研究旨在整合运用气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）技术，全面表征小鼠灌胃给予黄芪后心脑血管系统代谢稳态的变化，筛选差异代谢物并探讨黄芪发挥保护心脑血管作用的潜在机制。

1 材 料

1.1 药品与试剂

黄芪饮片（产地：甘肃，安徽协和成药业饮片有限公司）；甲醇和乙腈（HPLC 级，德国Merck 公司）；甲酸（HPLC 级，美国ROE Scientific 公司）；乙酸乙酯（分析纯，南京化学试剂公司）；氯化钠注射液（安徽双鹤药业有限责任公司）；甲氧胺（MOX，纯度大于99.9%）、N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（MSTFA，纯度大于98.5%）、吡啶（纯度大于99.9%）、内标（十七酸，格列本脲，纯度大于99.9%）以及代谢物标准品均购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 黄芪水提液制备

黄芪饮片经球磨机打粉后称取粉末10 g，按质量体积比1∶10（g∶mL）加入超纯水煎煮2 次，每次2 h，煎煮液经纱布过滤、合并滤液，冻干后保存于-80 ℃冰箱。每次灌胃前用超纯水新鲜配制质量浓度为1 g/mL的黄芪水提取液（以生药含量计）。

1.3 仪 器

超快速液相色谱-离子阱飞行时间质谱仪（UFLC-IT-TOF/MS）、GCMS-QP2010 Ultra 气相色谱质谱联用仪（日本岛津公司）；5430R 冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；TMS-200 超级恒温混匀仪（杭州奥盛公司）；低温恒温搅拌反应浴（郑州长城科工贸公司）；离心浓缩仪、冷冻干燥机（德国Labconco 公司）；Milli-Q 超纯水制备系统（美国Millipore公司）。

1.4 动 物

SPF级ICR小鼠13只，雄性，体重（18～22）g，购自常州卡文斯实验动物有限公司（许可证：SCXK（苏）2016-0010），动物实验遵循中国药科大学伦理委员会批准的《实验动物管理方法》等相关规定。小鼠饲养在标准动物房，每日光照12 h，温度20～25 ℃，湿度40%～50%，给予标准饲料及饮用水。

2 方 法

2.1 动物实验及样本采集

适应环境1 周后，随机分为对照组（Con，6 只）和黄芪组（AR，7 只）。AR 组连续灌胃给予黄芪水提液10 d，剂量为20 mL/（kg·d）（以生药含量计），Con 组灌胃给予同等体积生理盐水。最后一次灌胃结束后24 h，麻醉取血清，处死后取心脏和脑组织，所有样本于-80 ℃冻存。

2.2 样品制备

2.2.1 组织匀浆液 取脑或心脏组织100 mg 并剪碎，加80%甲醇（甲醇-水，8∶2）800 µL 匀浆，以6.5 m/s速度匀浆10 s，间隔30 s，重复3次。

2.2.2 LC-MS 分析前处理 样本室温解冻后涡旋10 s，取血清或组织匀浆液20µL，分别加沉淀试剂（甲醇-乙腈，1∶1，含内标格列本脲5µg/mL）140或100µL，涡旋后两次离心取上清液，用于LC-MS分析。

2.2.3 GC-MS分析前处理 取血清10µL 或组织匀浆液50 µL，加甲醇（含内标十七酸10 µg/mL）100 或50 µL，涡旋15 min 后，两次离心取上清液80 µL，加MOX（10 mg/mL）25 µL，37 ℃孵 育90 min，真空干燥，加MSTFA 120µL，37 ℃反应2 h后，将产物转移至进样小瓶用于GC-MS分析。

2.2.4 质控样本制备 为保证分析结果的可靠性，分别从每只动物的血清、心脏和脑组织匀浆液中吸取等体积的样品混匀后制得质控（QC）样本。大批量分析时，每间隔4 个待分析样本插入一个QC样本，同法处理分析。

2.3 仪器分析条件

2.3.1 LC-MS 分析条件 色谱柱为XSelect HSS T3 XP（2.1 mm×100 mm，2.5 µm，美国Waters 公司），0.01%甲酸水溶液（A 相）和乙腈（B 相）为流动相进行梯度洗脱。梯度洗脱程序如下：0.00～4.00 min，95%～50% A；4.0～10.00 min，50%～15% A；10.00～15.00 min，15%～0% A；15.00～20.00 min，0% A；20.00～20.01 min，0%～95% A；20.01～30.00 min，95%A。流速：0.4 mL/min，柱温40 ℃，进样量5µL。质谱采用电喷雾离子源（ESI）正负离子切换模式进行检测，毛细管电压分别为+4.5 和-3.5 kV；鞘气（氮气）压力：35 arb；辅助气（氮气）压力：15 arb；离子传输毛细管加热温度：320 ℃；全扫描的质量范围为100～1 000m/z，扫描时间为0.2 s。

2.3.2 GC-MS 分析条件 采用分流进样模式（血清样本分流比为20∶1，组织匀浆液样本分流比为50∶1），进样量1 µL。色谱柱为Rtx-5MS（30 m ×0.25 mm，0.25 µm），载气为氦气，流速为1 mL/min。色谱柱升温程序为70 ℃保持2 min 后，以10 ℃/min 的速度加热至320 ℃后再保持3 min。进样口、接口、离子源的温度分别设置为250、200、250 ℃。电离方式为电子轰击离子源（EI），电压为70 eV，扫描范围为45～600m/z。

2.4 数据处理与分析

LC-MS 和GC-MS 数据分别经Profiling Solution软件（日本Shimadzu 公司）进行峰提取和峰匹配后生成由质荷比-保留时间-离子峰强度构成的三维数据矩阵。对数据进行扣空白、峰过滤、缺失值填补、总面积归一化等预处理后，导入SIMCA-P 软件（Version 13.0，瑞典Umetrics 公司）进行正交转换偏最小二乘法判别（OPLS-DA）分析，计算变量投影重要性参数（VIP）。将数据导入SPSS 软件（Version 17.0，美国IBM公司），进行两独立样本非参数检验（Mann-Whitney U 检验）。同时满足VIP＞1、P＜0.05 以及绝对变化倍数（|FC|＞1.2 的变量即为差异变量。依据保留时间、质谱裂解碎片等信息，与HMDB 数据库（https：//hmdb. ca/）、NIST 谱库以及标准品图谱进行比对，鉴定差异变量。所得差异代谢物输入到在线处理软件MetPA（https：//www.metaboanalyst.ca/）中进行富集分析，并结合KEGG数据库（https：//www.genome.jp/kegg/）绘制代谢通路图。

3 结 果

3.1 数据可靠性考察

从血清、心脏、脑组织的LC-MS 原始图谱中分别提取出2 951，2 395 和1 912 个离子；从GC-MS谱图中导出2 802，2 336 和2 441 个离子。经计算比较发现，QC 样本的谱图重叠性较高（图1），超过90%的离子峰面积相对标准偏差（RSD）小于30%。说明本研究采用的分析方法及过程稳定、可靠，所得数据可用于进一步的分析。

Figure 1 Total ion chromatography(TIC)of representative QC samples

3.2 差异代谢物筛选鉴定及代谢通路分析

OPLS-DA 分析结果如图2 所示。3 种生物样本中，AR 组和Con 组均区分明显（LC-MS 模型参数：血清——R2X=0.517，R2Y=0.990，Q2=0.689；心脏组织——R2X=0.463，R2Y=0.981，Q2=0.641；脑组织——R2X=0.632，R2Y=0.998，Q2=0.842。GCMS模型参数：血清——R2X=0.541，R2Y=0.979，Q2=0.597；心脏组织——R2X=0.486，R2Y=0.998，Q2=0.967；脑 组 织——R2X=0.882，R2Y=0.979，Q2=0.763）。上述结果说明黄芪对小鼠血清、心脏和脑中的代谢物组都产生了显著影响。

Figure 2 OPLS-DA score plots of serum,heart and brain samples from control（Con）and AR treated mice

从血清、心脏、脑组织中分别鉴定出15、19 和17个差异代谢物（表1和表2）。经3种生物样本间比较分析，结果如图3 所示，差异代谢物棕榈酸和LysoPC（20∶3）为所有生物样本共有，且含量变化趋势一致：与对照组相比，棕榈酸显著下降，LysoPC（20∶3）显著升高。此外，甘氨酸为心脏与血清共有差异代谢物，含量均显著增加；丝氨酸、苯丙氨酸为脑与血清共有，丝氨酸均显著增加，苯丙氨酸变化趋势则相反；油酸、硬脂酸、LysoPE（20∶4）、LysoPC（18∶0）为脑与心脏共有，油酸、硬脂酸在两组织中均呈下降趋势，而LysoPE（20∶4）、LysoPC（18∶0）在心脏中均显著增加，在脑中则显著降低，变化趋势则相反。

整合鉴定出的40 个差异代谢物，进行代谢通路富集分析（图3-C），发现氨基酸代谢、脂肪酸代谢等途径变化显著。在此基础上，初步构建了小鼠心脑血管系统受黄芪水煎液影响的代谢网络（图4）。

Table 1 Differential metabolites in serum, heart and brain samples detected by LC/MS

4 讨 论

经黄芪干预后，小鼠血清、心脏、脑的代谢变化主要涉及氨基酸代谢、脂代谢与能量代谢。脂代谢涉及的物质主要包括溶血磷脂酰胆碱类（LPCs）、不饱和脂肪酸（UFA）及饱和脂肪酸（SFA）。LPCs 类物质可激活PPARδ，上调葡萄糖转运体GLUT4 的表达，维持脂质代谢稳态和胰岛素敏感性［13］。氧化应激损伤破坏神经元细胞膜，会导致侧链为不饱和脂肪酸的LPCs类物质含量显著下降［15-16］。本研究发现，相较于对照组，AR 组小鼠血清中LysoPC（16∶1）、LysoPC（18∶1）、LysoPC（20∶3）、LysoPC（20∶4）含量显著升高；AR 组小鼠脑中LysoPC（20∶3）和LysoPC（22∶6）水平上升，提示黄芪可能通过改善磷脂代谢提高机体胰岛素敏感性与缓解氧化应激造成的脑神经元损伤。

Table 2 Differential metabolites in serum, heart and brain samples detected by GC/MS

UFA 在防治心脑血管疾病方面发挥重要作用，自由基氧化造成的血清UFA 含量下降，易诱发高脂血症、动脉粥样硬化等血管疾病［17-18］。AR 组小鼠血清中3 种UFA：棕榈油酸、二十二碳六烯酸（DHA）和亚油酸（LA）含量上升，提示黄芪可通过抗氧化效应调节UFA 稳态而发挥改善血管疾病的作用。黄芪中的活性成分黄芪甲苷可以激活过氧化物酶体增殖物激活型受体α（PPARα），促进脂肪酸β-氧化，增强供能［5］。脂肪酸是心肌细胞主要能量代谢底物，有研究发现异丙肾上腺素诱导的心肌梗死模型动物心脏中长链脂肪酸β-氧化受损，发生蓄积［19］。AR 组小鼠心脏中棕榈酸、油酸、硬脂酸含量呈下降趋势，提示黄芪可通过改善脂肪酸代谢治疗心脏疾病。

Figure 3 A：Heat-map of the differential metabolites in mice serum,heart and brain;B：Venn diagram;C：Results of metabolic pathway enrichment

Figure 4 Effect of Astragalus on the metabolic homeostasis of the cardio-cerebrovascular system in mice

氨基酸不仅参与机体的能量代谢与蛋白质合成，还可合成多种生理活性物质。有研究发现，血中Gly 和苯丙氨酸（Phe）可作为早期预测T2DM 发生的生物标志物，胰岛素抵抗会导致患者血清中Gly 水平显著降低，Phe 含量增加［13，19］。本研究中AR 组小鼠血清中Gly含量上升，Phe含量降低的趋势提示黄芪可通过调节Gly 与Phe 代谢降低罹患T2DM 的风险。谷氨酸（Glu）是哺乳动物中枢神经系统（CNS）中主要的兴奋性神经递质。疾病状态下Glu 大量释放，会过度激活受体导致神经元兴奋、病变，产生兴奋性毒性，目前研究发现，Glu 大量释放是多种脑部疾病的病理特征之一，包括脑缺血、AD、创伤性脑损伤等［20-22］。酪氨酸（Tyr）是合成儿茶酚胺类神经递质去甲肾上腺素和多巴胺的重要前体，可以增强认知灵活性与记忆功能，具有改善认知障碍的潜力［23］。Ser 可促进细胞增殖，合成抗氧化剂谷胱甘肽与神经递质牛磺酸［24］。与对照组相比，AR 组小鼠脑组织中Glu 含量降低，Tyr、Ser、Phe 含量增加，提示黄芪可调节多种氨基酸代谢，维持脑神经递质稳态而发挥脑保护效应。

大脑主要以葡萄糖供能，充足的糖代谢对维持大脑正常生理功能十分重要。AR 组小鼠血清中葡萄糖的减少，脑中柠檬酸/异柠檬酸、琥珀酸水平的升高，反映了黄芪可提高脑中三羧酸循环代谢速率，增强能量供应。L-肉碱在心脏脂肪酸代谢中十分关键，它作为一种载体将脂肪酸从线粒体膜外转运至膜内进行β-氧化［25］，黄芪干预后小鼠心脏中L-肉碱含量降低，进一步提示黄芪可促进脂肪酸代谢，提高心脏能量供应。

本研究整合运用基于色谱-质谱技术的非目标代谢组学方法，考察小鼠灌胃给予黄芪水提液后机体的代谢变化，在血清、心脏、脑中分别发现了15、19、17 个差异代谢物，并聚焦于氨基酸代谢、脂类代谢及能量代谢等通路，从代谢调控角度初步阐明了黄芪“修心护脑”的作用机制。