蜂蜜中嗜渗酵母滤膜过滤法和涂布法对比分析

朱 平，淦永鉴，肖 芸，刘芯韵

（四川国检检测有限责任公司，四川 泸州 646000）

近来媒体少有关于蜂蜜中嗜渗酵母含量超标的报道，主要有两个原因，首先是蜂蜜企业对产品生产工艺的不断改进，其次是蜂蜜企业对产品质量检测的重视。既把好了生产关，同时又抓紧了出厂关。蜂蜜在出厂时对嗜渗酵母检测，使用商品化培养，避免检验员在检测嗜渗酵母时配置培养基的质量不好，影响检测结果的真实性，同时还能提高检测工作效率[1]。李闽真等[2]在春季采集的30 份巢蜜样品中嗜渗酵母检出率达100.0%，而在夏季采集的20 份巢蜜样品检出率为55.0%，说明蜂蜜的原材料中普遍都含有嗜渗酵母。

嗜渗酵母属于微生物，因此具备微生物所有的基本特性。虽然体积小，但是表面积大，在适宜的条件下生长繁殖速度快，新陈代谢也快。嗜渗酵母的大量存在会对蜂蜜品质和风味造成不利影响[3]。蜂蜜被嗜渗酵母污染后会影响其产品质量，一旦抽检检测出嗜渗酵母不合格，企业将会面临相应处罚，这样对蜂蜜生产企业来说就是负担，还会制约企业的发展，并使企业在消费者面前的形象受损。

1 实验方法

涂布法的操作过程参照GB14963-2011 附录A 中嗜渗酵母计数检测方法，在无菌环境下称量蜂蜜样品25 g 加入到225 g 30%葡萄糖溶液中，充分振荡或均质，制备成为1∶10 的均匀稀释液。用无菌吸管吸取稀释液1 mL，注入含有9 mL 30%葡萄糖稀释液的试管内，置于漩涡混悬仪上混匀，制备1:100 的稀释液。在充分混合稀释液之后，立即在每个平板表面接种0.1 mL。每个稀释度接种2 个氯硝胺18%甘油（DG18） 琼脂平皿[4]。

滤膜过滤法的操作过程参照 SN/T 4675.28-2016 出口葡萄酒中细菌、霉菌及酵母的计数方法。选用滤膜微孔径为0.45μm，用无菌镊子夹取无菌滤膜边缘，将正面朝上，贴放在已经灭菌的滤床上，固定好滤器。加入滤液，打开滤器阀门，在-0.5 个大气压下抽滤。抽滤完后，再抽滤5s，关掉滤器阀门和真空泵，取下滤膜，贴到培养基上，截留菌面向上，且膜与培养基之间不得有气泡[5]。在本实验过程中，过滤时，先注入约50 mL无菌生理盐水到滤杯中，然后分别加入0.1 mL，1 mL，10 mL 的蜂蜜均匀稀释液（1∶10），每个接种体积重复过滤一组平行平板。

2 结果

采用这以上种方法同时对同一蜂蜜样品进行实验，然后放置于同一培养箱内，25 ℃±1℃避光培养7 d。分为6 批次对蜂蜜样本开展实验。嗜渗酵母在平板上生长结果见表1。

表1 嗜渗酵母计数（CFU/平板）

每天都要对嗜渗酵母生长情况进行观察，并记录数目。膜上嗜渗酵母数目比较多且密集的时候，一定要尽量数清楚。如果7 天及以内，膜上嗜渗酵母已被霉菌覆盖，本实验以采用最近一次出的结果记录。当数量大于100 的时候，本实验记录结果为多不可计。嗜渗酵母计数最终结果见表2。

表2 嗜渗酵母计数（CFU/g）

蜂蜜以1:10 的均匀稀释液0.1 mL 接种涂布平皿时，实际蜂蜜的接种量约有0.01g，相当于100 倍稀释倍数。当以1∶100 的均匀稀释液0.1 mL 接种涂布平皿时，实际蜂蜜的接种量约有0.001 g，相当于1000 倍稀释倍数。100 倍稀释倍数就是最低稀释倍数。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。遇到这种情况，蜂蜜中嗜渗酵母的数量将会报告为小于100（CFU/g）。

由表2 可以看出，样品3 在两种方法下均无嗜渗酵母生长。样品2、样品5 以及样品6中嗜渗酵母含量≥100 CFU/g，涂布法和滤膜过滤法得到的结果都比较接近，重复性极限r=0.25，并无显著差异。当蜂蜜中嗜渗酵母含量大于1 且小于100 CFU/g 低含量时，这种涂布方法就会不容易检测出来，得到的结果为＜100 CFU/g。由此低含量的嗜渗酵母存在，势必会对蜂蜜后期储存过程中带来风险。

由本实验可知，过滤法能检测出＞1CFU/g的嗜渗酵母，样品1 和4 就是很好的例子。有利于企业在原材料和半成品以及成品监测中及时发现低含量嗜渗酵母，反馈到生产工艺中，找出产生问题原因，加强生产环节控制。