斑马鱼神经系统相关疾病模型的应用与药物筛选

蔡靖 李洁 蒋韵纯 卞薇洁 仲兆民

摘 要：斑马鱼作为一种良好的脊椎动物模式生物，因其与人类基因相似度高、饲养成本低、繁殖速度快、胚胎透明、个体较小、实验操作容易等特点，被广泛应用于遗传学和发育生物学的研究。随着研究的深入，斑马鱼已拓展到疾病模型和药物筛选等领域。研究表明，通过斑马鱼药物筛选获得的活性化合物大多在哺乳动物模型中有相似的效果，预示着斑马鱼模型在药物筛选中充满潜力。本文主要介绍斑马鱼模型在药物筛选中的优势，以及近年来斑马鱼模型在注意缺陷多动障碍、癫痫、阿尔兹海默症和帕金森病等神经性疾病的实验室模型建立与药物筛选的进展，旨在帮助人们了解斑马鱼在神经性疾病新药研发中的应用。

关键词：斑马鱼;疾病模型;药物筛选;注意缺陷多动障碍;癫痫;阿尔兹海默症;帕金森病

中图分类号：Q95 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2020）08-0210-04

1 斑馬鱼模型在药物筛选中的优势

药物研发周期往往漫长，如何在各研发阶段提高药物研发效率是迫切需要解决的问题。在临床前研究阶段，早先的研究人员主要通过各种细胞系进行高通量药物筛选。然而，细胞水平的筛选也存在一定的缺陷：细胞系是体外水平的筛选，并不能完全反映动物复杂的整体水平的状态;人类或动物体内不同细胞、不同组织、不同信号通路之间错综复杂，难以通过简单的细胞系模拟。因此，应用动物疾病模型进行药物筛选成为近年来的趋势。过往经验显示，非人灵长类动物和啮齿类动物模型虽然在解剖、生理和行为上与人类更加相似，但饲养成本高、难度大、实验周期长，在药物筛选研究中的优势不明显。与啮齿动物相比，在斑马鱼模型中进行研究所需的成本和时间更少，因此斑马鱼在药物筛选中脱颖而出，成为经济高效的药物筛选新宠。

斑马鱼的特点主要体现在以下几个方面：（1）成年鱼个体小，易于饲养：成年斑马鱼个体长约3～4cm，在有限的空间可以养殖相当大的群体，因此可开展大样本研究;（2）斑马鱼发育快速、性成熟期短、繁殖力强：其性成熟期一般为3个月左右，一尾雌鱼一般每次可产卵100～300枚，每周可产卵一次;（3）胚胎体外发育：斑马鱼体外受精，胚胎在母体外发育并且透明，受精卵的直径约1mm，易于观察和进行显微注射、细胞移植等操作;（4）斑马鱼属于脊椎动物，与人类的基因相似度高达85%。（5）具有较完善的胚胎和遗传学操作技术：例如利用CRISPR-Cas9系统构建遗传突变体、转基因品系、斑马鱼的细胞标记、细胞谱系跟踪、胚胎的细胞移植技术与低等模式生物类似，已经比较成熟;也可像在爪蟾上一样做胚胎的细胞移植[1]。综上所述，斑马鱼以其个体小、子代数量多、体外受精、胚胎透明等生物学特性可以适应高通量、实时和长时行为追踪及分析技术的应用，有助于研究人员进行全面地检测并评估药物的作用效果。同时，针对上文提到的药物在细胞水平的筛选具有的缺陷，作为一种整体动物模型的斑马鱼优势突出。此外，斑马鱼的基因组已经被完全测序，这有利于研究人员明确基因水平上的致病原理和药物作用机制，进一步提高药物筛选效率。

随着近期迅速发展的TALEN、CRISPR-Cas9等技术在斑马鱼中成功应用，对斑马鱼进行基因敲除、敲入等基因修饰的实验得到普及。在基因功能研究方面，转基因技术、基因过量表达技术、利用反义寡核苷酸抑制基因表达的技术、随机或定向诱变靶基因的技术、体细胞克隆技术等[2]蓬勃发展。尤为重要的是，在中高通量药物筛选中斑马鱼优势显著：（1）与啮齿类动物不同，斑马鱼幼体更接近“幼年”状态，神经系统成熟，重要器官功能正常，组织结构在受精后的最初几天内完全发育;（2）在96孔板中筛选幼鱼只需要毫克级别的化合物;（3）斑马鱼对药物库中通常使用的二甲基亚砜具有较好的耐受性;（4）溶解在游泳介质中的小分子化合物可通过皮肤从而快速扩散到达幼体的目标组织;（5）斑马鱼幼鱼的血脑屏障尚未形成，因此对于筛选能够影响神经系统的药物具有重要意义。

2 以斑马鱼为模式生物研究的相关行为疾病

斑马鱼具有强大的行为能力、完善的行为测试可用性和自动化行为测试仪器软硬件的适应能力[2]，因而成为研究神经紊乱疾病机制的高效模式生物（如图1所示）。斑马鱼幼体和成体在神经科学中的应用已经有了很大发展，因为它们与包括人类在内的其他脊椎动物具有高度的遗传和生理相似性，基因操作相对容易，中枢神经系统功能也有同源性，因此斑马鱼作为模式生物在研究人类行为相关疾病时优势明显。

2.1 注意力缺陷多动症（ADHD）

注意缺陷多动障碍是一种常见的去胆汁性神经发育障碍，影响全世界3%～7%的儿童，患者的症状大多数会持续到成年[3]。临床表现为与年龄和发育水平不相称的注意力不集中和注意时间短暂，活动过度与冲动，常伴有学习困难、品行障碍和适应不良的现象。但目前用于治疗ADHD的药物仅限于缓解症状，并不能彻底治疗或者及时预防。在已开发的几种ADHD啮齿动物模型，如大鼠、小鼠，并不能符合所有的有效性标准，如多动症相关行为。因此，开发、创新和验证替代补充模型以进一步探索多动症相关机制、研发筛选有关药物至关重要。

在斑马鱼的各种行为测试可以用来评估与研究多动症。例如，可以通过将斑马鱼幼鱼放在96孔板中，放入行为仪进行行为轨迹监测，以测量游泳发作频率（Hz）和持续时间（mm）、游泳速度（mm/s）、活跃游泳时间和总距离（cm）为标准，进行较长时间的记录来对斑马鱼幼体活动量进行评估。在五项选择系列反应时任务（5-CSRTT，5-choice serial reaction time task）中，研究人员通过测量成年斑马鱼对五种感知相同的刺激（呈现在五个不同的空间位置）的反应能力来评估其冲动程度和注意力。研究数据显示了这种实验模型在评估斑马鱼注意力缺陷多动症相关症状方面十分有效。

新型水箱测试也可以预测成年斑马鱼的多动症。新型水箱测试是最常用的评估运动和焦虑样表型的测试。该测试将单个斑马鱼放在一个新的环境中，它们通常在底部游泳，之后逐渐增加在水箱上部的活动。而评估总行程（m）、平均速度（m/s）、绝对转角和不动度（s）这些参数的变化均可用于多动症的表述。在斑马鱼中，性别差异会造成不同的行为，活动水平也会受到影响，这是研究多动症的一个重要因素。测试结果显示，与低活动度亚组的雌斑马鱼相比，高活动度亚组的雌斑马鱼更喜欢水箱的顶部，而雄斑马鱼则没有这种偏好[4]。

斑马鱼正迅速成为多动症研究的一种重要新型模式生物。已有多项斑马鱼行为测试显示了与这种疾病相似的行为表现，可以用来研究其背后的遗传与神经化学机制。最后，将基于行为的现象分析与药物筛选技术相结合，斑马鱼将成为发现治疗注意力缺陷多动症新药的重要动物模型。

2.2 癫痫（Epilepsy）

癫痫的主要特征是出现自发性反复发作（SRS，spontan-eous recurrent seizures）和高患病率的共病，如认知障碍、抑郁和焦虑，会严重影响个人生活。现有的20多种抗癫痫药物只能提供对症治疗，且可能出现认知改变、记忆混乱的副作用。此外，有30%的病人对现有抗癫痫药物没有反应。因此，新的癫痫治疗药物亟待研发。啮齿类动物模型且试验周期长、成本大、占用空间大;无脊椎动物雖为研究癫痫提供了重要的参考，但缺乏复杂的神经系统。因此，寻找简单、快速、特异和敏感的体内测试模型十分关键。

斑马鱼动物模型可以通过使用许多不同的基因编辑技术（如TALEN、CRISPR-Cas9技术），结合癫痫的独特特征来研究这种疾病的分子结构和行为基础。斑马鱼具有完全特化的基因组，与人类同源性较近;且具有一些传统啮齿动物模型所缺乏的，但有助于研究癫痫的关键特征：与啮齿类动物的小鼠相比，斑马鱼的胚胎发育很快，易于细胞观察和表型分析，可以作为研究癫痫发病机制（如早期暴露或老化）的理想选择。此外，斑马鱼幼鱼的血脑屏障尚未形成，神经系统对药物具有很高的敏感性，配合其完善的行为测试的可用性，以及自动化行为测试仪器软硬件的适应能力，使斑马鱼成为癫痫药物筛选十分重要的动物模型。

基于于癫痫自发性反复发作的特性，我们可以通过Danio Vision装置——一种带有红外摄像机被用作避光记录室的仪器，来监测斑马鱼的活动状况。在黑暗中斑马鱼度过1h，研究人员可以通过打开仪器内置的冷白色发光二极管发光至少1min，诱发斑马鱼光诱导的癫痫发作，再通过红外线分析游程和最大加速度，并提取游程轨迹，研究癫痫的独特特征。

目前，有关实验开始通过三轴迷宫试验（three-axis maze test）在药物筛选中判断斑马鱼模型的记忆问题。三轴迷宫是一种评估斑马鱼学习能力和自我中心记忆的方法，迷宫由一分为五的小室水槽组成，每个小室的角落或中心有一个窗口，一个漂浮的喂食环附在目标室迷宫的末端，鱼需要从一个腔室游到另一个腔室，通过插入物的窗口到达目标腔室获取食物。在三轴迷宫中，鱼需要根据x（向前/向后）、y（水平）和z（垂直）轴导航。在早期研究中，已经使用各种体外和体内模型对EMB（2，5-二羟基-3-十一烷基-1，4苯醌）进行了广泛研究，显示出EMB有强抗惊厥、抗焦虑和抗抑郁的特性，可以改善亨廷顿氏病（HD）、多发性硬化症（MS）、脑缺血和创伤性脑损伤（TBI）等病症[5]。此外，在成年斑马鱼身上使用戊四氮（PTZ），给予少量促惊厥药（PTZ）10d，使斑马鱼产生进行性慢性癫痫样行为，再进行三轴迷宫试验，每天检查记忆状态和癫痫发作的进展。结果显示PTZ处理过的鱼找不到它们去喂食环的路，反复迷路并返回到前一个隔间，而不是向前移动到喂食环。这意味着PTZ的使用损害了成年斑马鱼的记忆，之后给药（EMB）的鱼在三轴迷宫中则显著缩短了迷宫导航时间并减少了误差。上述结果发现EMB具有抑制癫痫样行为，并改善因慢性癫痫而改变的认知功能的作用。

通过几种药理学方法诱导成年斑马鱼癫痫样行为反应、使用各种类型的迷宫（如T轴或Y轴迷宫、光/色偏好测试和三轴迷宫）对斑马鱼进行学习和记忆功能测试，可见利用斑马鱼作为癫痫研究模型的趋势越来越明显。

2.3 阿尔茨海默症（AD）

阿尔茨海默病是一种进行性神经退行性疾病，其临床表现为记忆、认知和运动技能的障碍，以及影响运动的症状，如平衡、震颤、协调、失禁和进食困难等，而精神问题如抑郁、幻觉和妄想等也可能会出现。目前对人类阿尔茨海默症的治疗是基于护理，而不是预防性治疗。因此进行有效预防以及筛选出能够特异性治疗阿尔兹海默症的药物对于该疾病的防治具有十分重要的意义。

斑马鱼的神经系统保守简单，且拥有与人类阿尔茨海默症相关的同源基因（包括app、mapt、pesn1和pesn2等）。于此同时，斑马鱼还有一套与人类的行为表型相当的易观察量化的行为特征，被认为是研究神经退行性疾病的可靠脊椎动物模型。在阿尔茨海默症斑马鱼模型中，斑马鱼不仅表现出与人类相当的认知和记忆缺陷，还表现出运动障碍。研究人员可以通过用惊吓反应、惩罚性学习记忆模型和光介导奖励性实验来测试斑马鱼学习和记忆能力。对比健康斑马鱼的学习和回忆信息的能力，可检测出斑马鱼在阿尔茨海默症样状态诱发后的学习和记忆障碍，从而筛选用于治疗阿尔茨海默症的药物。

此外，斑马鱼非常适合Ca2+成像，它们相对简单的神经系统和胚胎的光学透明度允许实时神经成像。三维成像技术的快速发展，使整个生物体可视化，在疾病状态下可以进行详细的体内功能和神经生理学分析。目前，研究人员已经利用斑马鱼模型证明管花肉苁蓉提取物可以同时治疗阿尔兹海默症和骨质疏松，斑马鱼正在成为重要的阿尔茨海默病生物模型，尤其在神经发育和神经退化方面进一步的研究空间，预示着令人兴奋的研究机会。

2.4 帕金森症（PD）

帕金森病通常表现为肌肉僵硬、静止性震颤、运动迟缓和姿势不稳等，患者除了具有运动性障碍，甚至可能伴随着精神问题，如烦躁、抑郁、焦虑、睡眠障碍等非运动性症状[6-7]。

斑马鱼是研究运动障碍的一种良好的脊椎动物模型，研究人员通过免疫组化和原位杂交技术在斑马鱼胚胎中观察到一些特殊的神经元，此外，又在斑马鱼中发现了与帕金森症相关的蛋白同源物（PARKIN，DJ-1，PINK1和LRRK2），这些发现都预示着斑马鱼是一种筛选帕金森症潜在有效药物的优秀模式生物。

斑马鱼帕金森症模型的行为表型通常为运动能力迟缓（运动速度和幅度的下降），焦虑、抑郁，嗅觉障碍等。而引起斑马鱼上述行为表型的原因可能是多巴胺水平降低。有研究显示，rotenone处理后的斑马鱼是研究帕金森症的合适模型。通过明暗箱实验，rotenone处理后的鱼较正常组，在亮室中和进入暗室前的潜伏期都会变长，表现出焦虑和抑郁;在可监测斑马鱼行为的鱼缸中监测实验组斑马鱼的运动轨迹并处理数据，发现实验组斑马鱼的运动能力显著降低;向鱼缸中以一定速率输送氨基酸混合物，并软件跟踪斑马鱼的游泳路径，依据斑马鱼对氨基酸的特殊偏好性，发现rotenone也导致了实验组斑马鱼的嗅觉障碍。

斑马鱼大脑中的蛋白质，如NEFL、C13-1、NAV2和GAPVD1会在帕金森病表型中下调，这表明帕金森病表型与神经通路相关。斑马鱼相对较小的尺寸、光学透明性和生命周期是同时促进多种化合物研究的有效条件，如6-羟基多巴胺（6-OHDA）斑马鱼模型的建立，以筛选神经保护和神经恢复能力的药物。

因此，无论是从行为表型寻找、筛选潜在的帕金森症治疗药物，还是从分子层面分析其具体机制、通路，斑马鱼都是一种良好的模式生物。

3 总结与展望

斑马鱼良好的生物学特性使其非常适合活体高通量药物筛选，特别是在行为学基础上对神经系统相关疾病进行药物筛选，更有其独特优势，是基于靶标的药物筛选策略模式生物的有益补充。而近年来灵活、快捷和易操作性的定点基因组修饰技术和深度、高通量新一代RNA测序技术以及单细胞测序技术的出现，使斑马鱼作为模式生物的应用更加广泛。因此，我们能够利用斑马鱼的优势构建新基因型的斑马鱼，研究基因调控机制，进而利用斑马鱼模型筛选出能够治疗相关疾病的药物。但斑马鱼动物模型进入药物筛选领域的时间短，积累的数据不够多，与传统哺乳动物模型的对应关系不完备。相信在不同领域研究者的共同努力下，斑马鱼模型在药物筛选领域的应用会更加广泛深入，同时可以将药物筛选与斑马鱼已有的优势研究领域相结合，进一步加快药物研发进程，为人类健康做出贡献。

参考文献

[1] 孙智慧，贾顺姬，孟安明.斑马鱼：在生命科学中畅游[J].生命科学，2006（5）：431-436.

[2] A.V. Kalueff，A.M. Stewart，R. Gerlai.Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders[J].Trends in Pharmacological Sciences，2014（35）：63-75.

[3] G.V. Polanczyk，G.A. Salum，L.S. Sugaya，A. Caye，L.A. Rohde.Annual research review： a meta-analysis of the worldwide prevalence of mental disorders in children and adolescents[J].

Clinical Child Psychology and Psychiatry，2015（56）：345-365.

[4] B.D.Fontana，F.Franscescon，D.B.Rosemberg，W.H.J.Norton，A.V.Kalueff，M.O.Parker.Zebrafish models for attention deficit hyperactivity disorder（ADHD）[J].Neuroscience and Biobehavioral Review，2019（100）：9-18.

[5] S. Mahendran，B.S. Thippeswamy，V.P. Veerapur，S. Badami.Anticonvulsant Activity of Embelin Isolated From Embelia Ribes[J].Phytomedicine，2011（18）：186-188.

[6] 黃娟，吴大鸿，吴立新，等.帕金森综合症的病因及治疗分析[C].贵州省第七届中西医结合神经科学术年会论文汇编，2015：189-191.

[7] 刘峘，谢雁鸣，易丹辉，等.帕金森综合征患者合并病特征与临床用药特点分析[J].中国中药杂志，2014，39（18）：3493-3498.