兰州百合多酚提取工艺优化研究

（静宁县食品药品检验检测中心，甘肃 静宁 743400）

植物多酚是植物体内广泛存在的一种芳香族羟基衍生物的总称，其数量庞大，迄今已知的酚类物质已有8 000种以上[1]。由于其结构复杂、化学活性显著且存在形态多样，因而多酚类物质的研究进展十分缓慢[2]。20世纪中期以后，植物多酚与多种生物活性物质的化学反应及其抗氧化、清除自由基等一系列优越功能被逐步发现，研究人员也开始重视这一研究领域[3]。百合是一种有较高营养保健价值的蔬菜，有极高的食用价值。兰州百合含糖量高，粗纤维少，肉质细腻，还含有许多有益成分[4]，其中多酚含量就相当可观[5]。

多酚是多羟基化合物，其结构特点决定多酚易溶或可溶于水、醇类、醚类、酮类等。目前，关于兰州百合多酚提取工艺的方法主要有溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、生物酶解提取法等[6-7]。有机溶剂提取法常用的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等，此法有提高多酚得率、缩短提取反应时间等优点。本试验采用有机溶剂提取法对兰州百合多酚的提取工艺进行研究，通过正交试验设计筛选最优工艺参数，以期为兰州百合多酚的提取开辟一条具有工业开发前景的新途径。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

兰州百合干自兰州天顺百合商贸有限公司采购，粉碎后过0.15 mm筛，备用；乙醇、无水碳酸钠、丙酮、甲醇、乙醇、盐酸、氢氧化钠均为国产分析纯，福林酚、没食子酸购自北京市索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2501PC型紫外-可见分光光度仪（日本岛津公司）；DK-98-1型电热恒温水浴锅，FW80型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；IKAMAG RCT型磁力加热搅拌器（德国IKA-Werke公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素影响试验

分别考查溶剂类型、料液比、溶剂体积分数、超声功率、提取温度和提取液pH值等单因素对兰州百合多酚得率的影响，试验方法如下：

溶剂种类因素试验：称取一定量兰州百合粉末，按照1∶30比例分别加入体积分数均为90%的甲醇、乙醇、丙酮溶液，采用1 mol/L HCl或NaOH调节溶液pH值为7，在温度为40 ℃条件下提取25 min后，在2 000 r/min离心10 min后收集上清液，测定兰州百合多酚含量，每组3个重复。

料液比因素试验：准确称取相同批次的兰州百合各1.0 g，按照料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，g/mL）加入浓度为90%的乙醇溶剂，溶液pH值为7，在超声功率500 W，温度40 ℃下，提取25 min后，分别离心并收集提取液，定容至100 mL，测定各处理兰州百合多酚得率，每处理3次重复。

溶剂体积分数因素试验：准确称取相同批次的兰州百合各1.0 g，按照1∶30比例加入不同浓度的乙醇溶剂（60%、70%、80%、90%、100%），溶液pH值为7，在超声功率500 W，温度40 ℃条件下提取25 min后，分别离心并收集提取液，定容至100 mL，测定各处理兰州百合多酚得率，每处理3次重复。

超声功率因素试验：准确称取相同批次的兰州百合各1.0 g，各加入浓度为90%的乙醇溶剂，溶液pH值为7，在不同超声功率（400、500、600、700、800 W），温度40 ℃条件下，提取25 min后，分别离心并收集提取液，定容至100 mL，测定各处理兰州百合多酚得率，每处理3次重复。

提取温度因素试验：准确称取相同批次的兰州百合各1.0 g，按照1∶30比例分别加入浓度为90%的乙醇溶剂，溶液pH值为7，在超声功率500 W，不同温度（30、40、50、60、70 ℃）下，提取25 min后，分别离心并收集提取液，定容至100 mL，测定各处理兰州百合多酚得率，每处理3次重复。

提取液pH值因素试验：准确称取相同批次的兰州百合各1.0 g，分别加入浓度为90%的乙醇溶剂，调节溶液pH值（5、6、7、8、9），在超声功率500 W，温度40 ℃下，提取25 min后，分别离心并收集提取液，定容至100 mL，测定各处理兰州百合多酚得率，每处理3次重复。

1.3.2 多酚提取正交试验设计

在单因素试验基础上进行L9（34）正交试验，乙醇浓度（A）设3个水平：80%、90%、100%；提取温度（B）设3个水平：30、40、50℃；pH值（C）设3个水平：6、7、8；超声功率（D）设3个水平：400、500、600 W。

1.3.3 最优条件的验证试验

将正交试验获得的最优条件进行3次重复试验，计算兰州百合多酚平均得率。

1.4 多酚得率测定方法

多酚质量浓度：称取0.1 g没食子酸，加入100 mL蒸馏水，制备1.0 mg/mL没食子酸溶液[8]。分别取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL至50 mL容量瓶中，加入2 mL福林酚试剂摇匀，静置5 min，滴加4 mL质量分数10%碳酸钠溶液，置于25 ℃的恒温水浴锅中，显色2 h后在760 nm波长处测定吸光度，以多酚质量浓度（以没食子酸计）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到多酚的标准曲线方程：y＝1.958 8x＋0.059 1，式中：y为所对应的吸光度；x为多酚质量浓度（以没食子酸计，mg/mL）；相关系数r2＝0.999 1，表明该回归方程的拟合度高，可准确计算多酚质量浓度。

多酚得率：取兰州百合提取液全部，定容至100 mL，取待测液0.5 mL，加入0.5 mL蒸馏水，再加入福林酚0.2 mL，反应3～8 min，再加入饱和碳酸钠溶液1 mL，黑暗反应1 h，再用蒸馏水定容至5 mL，在760 nm波长处测定吸光度。由标准曲线得到提取液中多酚质量浓度，并计算多酚得率（ω）。

ω（mg/g）＝10x×M×n×V×2 ，式中：x为多酚质量浓度（mg/mL）；M为兰州百合质量（g）；n为稀释倍数；V为提取液体积（mL）。

1.5 数据分析方法

所有试验结果分为3组，结果数据均取平均值。使用Excel 2007进行方差分析（ANOVA）评估统计显著性。

2 结果与分析

2.1 单因素影响试验结果

2.1.1 溶剂种类对兰州百合多酚得率的影响

目前多酚提取试验一般采用有机溶剂断裂氢键来产生多酚，不同的溶剂对植物多酚提取率有不同的影响[9]。乙醇是最常用的工业提取剂，其价格低廉，安全性高，有利于清洁生产，来源广泛，且对人体无毒害作用。由图1可知，随着水浴时间的增加，兰州百合多酚得率越来越高，其中，乙醇的提取效果最好。故选择乙醇作为兰州百合多酚的提取溶剂进行后续工艺优化试验。

2.1.2 料液比对兰州百合多酚得率的影响

多酚与溶剂间的浓度差是多酚提取的推动力，选择适宜的料液比，不仅有利于提高多酚传质速率和多酚得率，还能降低溶剂消耗与生产成本[10]。由图2可知，兰州百合多酚得率随提取溶剂用量增大而逐渐升高，当料液比达到1∶30（g/mL）后，多酚得率达到最大值。这是由于兰州百合多酚已大部分溶出，继续增加溶剂用量效果不再显著，反而会造成溶剂损耗；因此，后续试验确定为1∶30。

2.1.3 乙醇浓度对兰州百合多酚得率的影响

多酚通常与植物大分子物质以氢键等形式结合形成稳定化合物，一般采用有机溶剂断裂氢键来产生多酚，不同溶剂体积分数对多酚得率影响也较大[11]。由图3可知，多酚得率随着乙醇体积分数的升高而增大，当乙醇浓度为90%时提取效果最好。分析乙醇溶液体积分数的变化规律，当溶剂用量过低时，极性过强，导致糖类等水溶性物质萃出量增大，对兰州百合的提取有较大影响；若采用无水乙醇则造成极性太低，达不到断裂化学键的目的。

另外，提取时间对目标物质的生产周期和效率影响较大，不同提取时间也同样影响着多酚得率。由图3可知，采用90%乙醇在提取开始20 min内，兰州百合多酚得率逐渐增高，在20 min时达到最大值，之后趋势比较平缓。这可能是由于兰州百合中的多酚类在最初的20 min内就已基本提取完成，随着提取时间的延长，可溶出的多酚类物质越来越少。

2.1.4 超声功率对兰州百合多酚得率的影响

超声波振荡可以破坏植物细胞的细胞壁，增加提取率。从图4可以看出，超声功率的大小对试验结果具有一定的影响，随着超声功率的增加，多酚得率出现先增大后下降的趋势；因此，选择500 W作为多酚提取的最佳超声功率。从图4还可得出，随着超声提取时间的延长，多酚通过超声破碎逐渐溶出，并在20 min基本达到最大，20 min以后多酚得率基本没有变化，所以超声提取时间延长对多酚的提取并没有好处，反而对细胞内物质有一定破坏，增加目标产物的提取难度。

2.1.5 提取温度对兰州百合多酚得率的影响

较高的处理温度可加快分子运动及传质速率，但温度过高将导致多酚中的热不稳定性成分产生氢化而被破坏[11]。由图5可知，在30～50 ℃范围内，多酚的提取速率最大，其中在40 ℃下提取20 min时多酚得率最大，达到87.59 mg/g；当温度高于40 ℃时多酚得率逐渐下降，这可能是由于多酚类物质在高温条件下易被氧化，部分多酚类物质结构发生改变所致。

2.1.6 提取液pH值对兰州百合多酚得率的影响

适宜的酸度可增加植物组织细胞的通透性，并抑制多酚氧化酶的活性，这不仅有利于有效成分的溶出，还减小了酶促氧化反应的产生，均可提高多酚得率。由图6可知，当提取液pH值为7时，多酚得率最佳，由此可知，兰州百合多酚的提取液最佳pH值为7。

2.2 正交试验结果及验证试验

在上述单因素试验基础上，又对兰州百合多酚提取进行了正交试验设计，表1结果表明：影响多酚提取的因素由强到弱依次为A＞B＞C＞D，分别是乙醇浓度＞提取温度＞pH值＞超声功率；由此可见，提取温度、乙醇浓度对兰州百合提取多酚的影响较大，最优的工艺组合为A1B2C2D2，即最佳提取工艺参数组合为乙醇浓度为80%、提取温度为40 ℃、提取液pH值为7、超声功率为500 W。

在上述最优工艺组合基础上进行3次验证试验，得到兰州百合多酚平均得率为100.27 mg/g。

由方差分析结果可知，乙醇浓度、提取温度和提取液pH值3因素的F值＞P值，说明对兰州百合提取多酚的影响具有一定意义。

表1 兰州百合多酚提取L9（34）正交试验结果

3 结论与讨论

本试验采取正交试验设计对兰州百合中多酚的提取条件进行了优化研究，在单因素试验确定了溶剂种类基础上，当继续增加料液比时，多酚得率增加不显著，考虑后期工业化应用时料液比增加会增大生产成本，所以确定为1∶30，故选择乙醇浓度、提取温度、提取液pH值和超声功率4因素进行优化正交试验设计，以获得较佳提取条件。L9（34）正交试验结果表明，影响多酚提取的因素分别是乙醇浓度＞提取温度＞pH值＞超声功率，最佳提取工艺参数组合为乙醇浓度80%、提取温度40 ℃、提取pH值为7、超声功率为500 W。在最优工艺组合基础上进行3次验证试验，得到兰州百合平均多酚得率为100.27 mg/g，可以为兰州百合多酚提取工厂化深入研究提供一定依据。

当然，影响兰州百合多酚得率提取的因素有很多。例如，在兰州百合种植过程中，其多酚含量会受到品种[12]、气候[13]、季节[14]、产地[15]、肥水管理[16]因素的影响；在兰州百合收获过程中、收获后的保藏方式以及烘干方式也会影响多酚的含量；在试验过程中，其粉末颗粒度的大小以及提取方法同样都会影响多酚的提取。这些因素对兰州百合中多酚提取的影响还有待于进一步研究加以确定。