花生中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取及含量测定

郝旭晨 董燕婕 范丽霞 苑学霞 梁京芸 王磊 李大鹏 赵善仓

摘要：建立高效液相色谱紫外法同时测定花生中白藜芦醇和白藜芦醇苷含量的方法。以85%乙醇水溶液为提取剂，采用直接超声提取、高速匀浆提取和固相萃取3种不同提取方法处理花生样品，对提取剂使用量和提取方法进行比较研究，高效液相色谱法进行含量测定。结果表明：当提取剂使用量为40mL时，固相萃取提取法效果最好，白藜芦醇的加标回收率为9600%～10955%，相对标准偏差（RSD）为164%～217%，检出限为0016mg/kg;白藜芦醇苷的加标回收率为9182%～10467%，相对标准偏差（RSD）为173%～281%，检出限为0052mg/kg。测定的山东省210个花生样品中白藜芦醇含量为017～1139mg/kg，含量最低的是花育22，最高的是白玉品种;白藜芦醇苷含量为022～144mg/kg，含量最低的是春甜，最高的是山花9号品种。该方法适合于花生样品中白藜芦醇和白藜芦醇苷含量的测定。

关键词：花生;白藜芦醇;白藜芦醇苷;高效液相色谱法

白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，主要存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[1]。白藜芦醇苷，又称虎杖苷，是从蓼属植物虎杖根中提取的一种多酚类物质，化学名称为3，4，5三羟基芪3βD葡萄糖苷，苷元为白藜芦醇，糖部分为单D葡萄糖。白藜芦醇分子中的羟基与葡萄糖结合而形成白藜芦醇苷。研究表明，白藜芦醇苷具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、减轻多种因素造成的组织器官损伤、保护肝细胞、降血脂等作用[2]。白藜芦醇苷和白藜芦醇具有相似的生物活性，白藜芦醇苷可在体内代谢为白藜芦醇[34]，在肠道中糖苷酶的作用下分离出白藜芦醇[57]。

花生是我国主要的油料作物，富含白藜芦醇以及白藜芦醇苷等营养功能成分。高效液相色谱（HPLC）法具有高灵敏度、高效能和高速度的特点，广泛应用于葡萄酒、虎杖、花生等样品中白藜芦醇的检测[811]。韩寒冰等[12]研究珍珠红14、粤油114、汕油523和湛油75等花生品种的废弃物中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量，为花生废弃物的综合利用提供了科学依据。目前同时提取和测定白藜芦醇和白藜芦醇苷的研究也主要集中在虎杖、葡萄、葡萄酒和桑椹等[1315]。杨润涛等[16]同时测定了血浆中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量。禹珊等[17]同时测定了中药虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的含量。HPLC法测定白藜芦醇的含量，样品前处理方法的不同将直接影响测定结果[18]。白藜芦醇难溶于水，易溶于乙醚、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂[1920]，对白藜芦醇的提取率由低到高依次为丙酮<无水乙醇<甲醇<乙醚<乙酸乙酯，因為乙醇具有无毒、安全、价格低廉、易得、易回收的特点[21]，大多选择乙醇作为提取白藜芦醇的试剂较适宜。

经查阅文献，对于同时检测花生中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量还未有相关的研究性试验。本研究参照GB/T 24903—2010标准优化前处理方法，对花生中白藜芦醇和白藜芦醇苷进行同时测定，以建立提取效果好、回收率高、重复性好的检测方法。

1材料与方法

11试剂

白藜芦醇，纯度≥98%，中国食品药品检定研究院;白藜芦醇苷标准品，纯度≥98%，上海安谱实验科技有限公司;乙腈（色谱纯）;无水乙醇（分析纯）;氧化铝分层柱（0074～0149mm）;娃哈哈纯净水;022μm有机滤膜。

12仪器

Waters2695高效液相色谱仪，仪器配Waters 2998光电二极管阵列检测器;IKA MS3 digital涡旋仪;Sigma 3K15医用离心机;美国NEVAP111氮吹浓缩仪;KQ800DE超声仪。

13方法

131标准储备液的配制分别称取白藜芦醇和白藜芦醇苷标准品各125mg（精确至0000 1g）置于250mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成质量浓度为50mg/L的白藜芦醇、白藜芦醇苷标准储备液，保存于4℃。临用时，用甲醇稀释成不同浓度的标准使用液[22]。

132标准工作液系列的配制甲醇稀释白藜芦醇和白藜芦醇苷标准贮备液得到005、01、05、10、20、50、100mg/L的混合标准溶液。

133样品前处理方法

（1）直接超声提取法。称取250g花生粉状样品于50mL离心管中，加入85%乙醇水溶液25mL，置于80℃超声仪中水浴超声25min，冷却后于5 000r/min离心5min，残渣再用25mL 85%乙醇水溶液再次提取，充分涡旋混匀1min，重复以上超声离心步骤，合并提取液，涡旋混匀。吸取2mL上清液，过022μm有机滤膜待用[23]。

（2）高速匀浆提取法。称取25g花生粉状样品于50mL离心管中，加入85%乙醇水溶液10mL高速匀浆2min后，于4 000r/min离心10min。将上清液转入50mL容量瓶中。残渣分别用20mL 85%乙醇水溶液提取2次后合并提取液，定容。摇匀后用022μm滤膜过滤，待用[24]。

（3）固相萃取法。称取50g花生粉状样品于50mL离心管中，加入85%乙醇水溶液40mL于80℃超声水浴45min，不时振摇。静置过夜后吸取8mL上清液过氧化铝层析柱，收集滤液到10mL刻度管。40℃氮吹滤液至1mL，用022μm滤膜过滤，待用[22]。

134高效液相色谱条件色谱柱条件为TnatureC8色谱柱（46mm×250mm，5μm）;柱温为25℃;检测波长为306nm;流动相A为900μL冰醋酸+1 000mL水;流动相B为乙腈;进样量为10μL;检测器为二极管阵列检测器（表1）。

2结果与分析

21标准曲线的建立

在最优试验条件下，对不同浓度梯度的白藜芦醇标准品和白藜芦醇苷标准品分别作标准曲线。结果表明，白藜芦醇及白藜芦醇苷混标在质量浓度为005～10mg/L时，质量浓度（C，mg/L）与其峰面积（A）呈良好的线性关系，相关系数大于0999（表2）。

24方法重复性和准确度比较

在花生粉碎样品中添加混合标准溶液，使添加质量分数分别为10、50、100mg/kg。每个浓度水平重复5次，分别按照步骤“121、122、123” 3种前处理方法处理样品，进行精密度与准确度的测定，3种添加浓度的方法重复性及回收率列于表4。

3讨论与结论

目前，研究白藜蘆醇苷提取的材料是虎杖[2526]和葡萄[2729]。但对花生生产中白藜芦醇苷的检测未见报道。本研究比较了3种花生样品前处理方法的LOD、LOQ、回收率以及精密度，结果表明，固相萃取法的回收率高于高速匀浆提取法和直接超声提取法，而且溶剂的使用量低。溶剂直接提取法提取试剂消耗量大，且提取效率不高。高速离心法的提取率略低于固相萃取柱，存在试剂消耗、提取不完全的问题。固相萃取法采用样品提取后静置过夜，使白藜芦醇以及白藜芦醇苷与萃取剂充分接触，提高萃取效率。固相萃取柱中含有氧化铝成分，吸附样品基质中的偏极性化合物，可以将白藜芦醇和白藜芦醇苷与花生样品中的其他杂质实现有效分离。

采用固相萃取法在获得最佳净化效果的同时可得到最佳的回收率，优于高速匀浆提取法和直接超声提取法，白藜芦醇的加标回收率为9600%～10955%，相对标准偏差（RSD）为164%～217%;白藜芦醇苷的加标回收率为9182%～10467%，相对标准偏差（RSD）为173%～281%。测定的山东省210个花生样品中白藜芦醇含量为017～1139mg/kg，含量最低的是花育22，最高的是白玉品种;白藜芦醇苷含量为022～144mg/kg，含量最低的是春甜，最高的是山花9号品种。◇

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