饲料磷脂对三疣梭子蟹酚氧化酶活性的影响

易柯含

摘 要：目的：以实验室养殖和市场销售的正常三疣梭子蟹为研究对象，探究饲料磷脂水平对甲壳动物酚氧化酶活性的影响，为三疣梭子蟹的营养免疫学研究和梭子蟹饲料的开发提供科学依据。方法：将达到试验规格的三疣梭子蟹随机分成A1、A2、B1、B2四组。A1和A2组为蛋黄磷脂平行组，用以投喂该两组的配合饲料中添加足量蛋黄磷脂为主要磷脂源。B1和B2组为大豆磷脂平行组，用以投喂组B1、B2的配合饲料中添加足量大豆磷脂为主要磷脂源。人工饲养8周后，从A1、A2、B1、B2各组随机抽取4只蟹，测定其血清和HLS的酚氧化酶活性，并与市场组（C组）梭子蟹血清和HLS的酚氧化酶活性作比较。结果：血细胞样本中，市场组总活力均值为2.67，高于试验各组的活力均值（1.13～1.47），差异显著，而试验各组之间没有显著性差异。A1、A2、B1、B2四组比活率分别为0.58、0.38、0.49、0.32，四组之间不存在显著性差异，而市场组比活率为2.20，显著低于试验各组。血清样本中，试验各组的总活力值均在1.40～1.99之间，组间不存在显著性差异;A1、B1、B2组的比活率值都在1.97～2.68之间，无显著差异。B组比活率平均值为4.44，与A1、B1、B2组有显著差异。结论：作为磷脂源，卵黄磷脂和大豆磷脂对梭子蟹HLS的酚氧化酶活性均无显著影响，而试验组血清酚氧化酶活性比活率明显高于市场组，说明在一定程度上，卵黄磷脂和大豆磷脂对血清中的酚氧化酶活性有促进作用。

关键词：三疣梭子蟹;磷脂;非特异性免疫;酚氧化酶

三疣梭子蟹具有肉质好、食物链短、生长快、产量高等优点。20世纪80年代后期开始，由于过度捕捞，东海中南部海区梭子蟹资源出现衰退[1-2]。近年来，随着养殖业的迅速发展，由高密度养殖、过剩投饵等原因带来的养殖环境的急剧恶化，已经造成了由细菌、病毒引起的传染性疾病，这给水产养殖业带来了巨大的经济损失[3]，严重阻碍了梭子蟹养殖行业的健康发展。传统的病害防治方法主要是依靠化学类合成药物，但实践证明，长期使用抗生素会在动物体内造成药物残留物的沉积，这不仅降低了水产品的质量，同时也降低了甲壳动物自身的免疫力，并对人类健康造成诸多影响。国内对这类药物的使用已做出了明确限制[4-5]。

甲壳动物的细胞免疫包括吞噬作用、包围化及结节的形成，体液免疫包括酚氧化酶原激活系统、各种凝集素及抗菌肽等。酚氧化酶原活化系统又被称为酚氧化酶（PO）前体格状物，其结构成分，如革兰氏阴性菌中的脂多糖（LPS）和真菌中的β-1，3-葡聚糖能特异性活化丝氨酸蛋白酶（PPA），PPA被激活后，作为激活剂进一步激活酚氧化酶原[6-7]。PO一般以无活性proPO的形式存在于甲壳动物体内，它主要来源于血细胞中的颗粒细胞和半颗粒细胞，入侵的细菌等异物作用于甲壳动物的这两种细胞，刺激细胞产生胞吐作用，并进行脱颗粒激活，使proPO释放PO，同时产生76 KD 蛋白和α-巨球蛋白。这一反应链的短暂氧化产物（单酚和酚）对微生物具有杀伤能力;而黑色素则可抑制病原体胞外蛋白质和几丁质酶的活性，并介导黑化反应，在病原体表面形成小结块，杀死病原体[8-9]。酚氧化酶活性（Apo）因甲壳动物所处环境条件、生理状态和营养水平的不同而有所差别。研究表明，Apo值的高低可以作为反映甲壳动物免疫状况的指标，并从侧面反映出甲壳动物健康状况及免疫灵敏性之不同[10]。有关磷脂对甲壳动物免疫状况的影响在国内外鲜见报道，所以，本研究以实验室养殖和市场销售的正常三疣梭子蟹为研究对象，分别以足量蛋黄磷脂和大豆磷脂为主要磷脂源，制成了两种配合饲料，用以投喂实验室养殖梭子蟹，以Apo为主要免疫性能评价指标，并与市场销售的正常三疣梭子蟹Apo作比较，通过测定其体液免疫中的相关酶含量，以达到探讨饲料磷脂对三疣梭子蟹Apo的影响的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 三疣梭子蟹种苗，产于浙江省海洋研究所西轩厂区，分为20个组，每个组放在圆柱形的水缸中，水缸中拥有1个由三层八边形组成的蟹笼，采用微循环换水，给每个养殖缸提供不间断的沙滤海水（15 L/min）;每个缸内都安置1个气石，保持24 h增氧，使溶解氧保持在7 mg/L左右;水温控制在24～30℃;盐度大约在30;水体pH值7.6左右;采用自然光照，使各试验组有相近的光照强度，每天用不同组分的饲料早晚喂料1次，养殖10周。试验时，每个组随机取5只三疣梭子蟹用于试验。样本用于试验前，经过饥饿处理（空腹1d）。

1.1.2 养殖管理 以鱼粉（质量分数60%）为主要蛋白源，试验共准备了2种人工配合饲料。在基础配方中分别添加足量蛋黄磷脂、大豆磷脂，并分别记为饲料组1、2。过筛制粒后，于-20℃冰箱中冷冻保存备用。先将试验用的梭子蟹在实验室条件下进行暂养，适应一段时间后正式开始试验，将达到试验规格的三疣梭子蟹随机分成A1、A2、B1、B2四组，放入八边形白色塑料蟹笼中，使每个试验组个体总质量尽量相近。A1、A2两组投喂饲料组1，B1、B2两组投喂饲料组2。每天于9∶00、17∶00各投料1次，按体重的4%投喂。每隔一段时间，换1/4桶水，排掉桶底污物。

1.1.3 仪器 消毒注射器、烧杯、玻璃棒、量筒、胶头滴管、500 mL容量瓶、电子天平、pH测定仪、移液枪（Eppendorf）、吸头、吸头盒、1.5 mL离心管、T10基本分散机、CT15RE型高速（冷冻）微量离心机、BIO-RAD iMark酶标仪、96孔板、冰袋等。

1.2 方法

1.2.1 血样的采集 养殖8周时间后，从每个组随机抽取4只梭子蟹采血，樣本在试验前，已经过饥饿处理（停料1d）。用消毒的5 mL注射器从三疣梭子蟹背壳部上方插入，在心脏位置抽取血淋巴。注射器中预先吸入1 mL已灭菌的预冷抗凝剂（0.14 mol/L氯化钠、0.1 mol/L葡萄糖、0.03 mol/L柠檬酸三钠、0.026 mol/L柠檬酸、pH值5.0）。

1.2.2 PO活力的测定 （1）经过2次离心，用Tris-HCl buffer冲洗过的血细胞样本中注入100 μL Tris-HCl buffer，使用T10基本分散机超声破碎Hemocytes（操作3s、停5s，反复8次，冰上操作），在12 000 r/min（配平到0.01位）、4℃条件下，离心10 min，取上清，即血细胞破碎液上清（HLS）（血清总活力的测定参照步骤2进行）;（2）将20 μL HLS添加到96孔板，再分别用移液枪注入200 μL L-DOPA（5 mmol/L的L-LOPA溶液，称量约0.1 g，用100 mL双蒸水溶解），另设一组阴性孔对照，只加Tris-HCl缓冲液，静置10～15 min，室温下（22℃）温育。用BIO-RAD iMark酶标仪测定样品在A490 nm波长下的光吸收值，读数7次，间隔时间设置为5 min。将光吸收每分钟增长 0.001定义为1个活力单位（Unit），计算公式为式（1）：

PO=（OD-ODO-ODL）/t（1）

式（1）中，OD代表所选时间段终点处的光吸收值;ODO代表所选时间段起点处的光吸收值;ODL代表这段时间内，t则代表反应时间，只加Tris-HCl 缓冲液的阴性孔，其光吸收的增加值。

2 结果与分析

2.1 血细胞和血清样本的处理

超低温冻存的实验室养殖梭子蟹血清样品在5 000 r/min、4℃条件下，离心5 min后，出现了少量白色块状絮凝，而在市场购买的正常梭子蟹，其血清并未出现这种现象。

2.2 蛋白浓度标准方程

0.5 mg/mL BSA的标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL梯度加到96孔酶标板中，用Tris-HCl buffer分别补足至20 μL，则其稀释后浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，每个浓度梯度设置了3个平行样，计算出每个浓度中3个平行样吸光度的平均值，以BSA浓度为横坐标、其光吸收随时间的变化值为纵坐标，用Excel软件作图得到其标准曲线和蛋白质标准方程y=0.536 4x+0.265 6（图1）。

2.3 试验样品蛋白浓度的测定

将HLS和血清样本在A595 nm波长的吸光度（OD值）代入标准方程y=0.536 4x+0.265 6中，即可得到对应的蛋白浓度值x。以样品B2-2为例，其血清样本按4、5、10、20μL梯度注入到96孔酶标板中，用Tris-HCl buffer分别补足至20μL，则其稀释倍数分别为5、4、2、0。样本在A595 nm处的吸光度（OD）见表1，计算在这个浓度下的血清蛋白浓度值，并乘以稀释倍数，则得到了其血清蛋白的原浓度值，又由于未稀释组的细胞蛋白浓度为0.791>0.5（标准蛋白曲线中BSA的最大浓度值），此数值落在了置信区间之外，应舍弃，所以其原浓度值为（1.165+1.472+1.178）/3=1.272。

2.4 试验样品酚氧化酶活性测定

根据0.5h内光吸收值随时间的变化量，用Excel软件得到各组的回归曲线，通过R2来选择代入合适的OD、ODO值（图2）。加入20 μL血清的样品A1-1光吸收随时间变化的趋势线，R2=0.995 7，则可用5、30min两个时间点对应的光吸收值代入式（2）：

PO=（OD-ODO-ODL）/t（2）

加入20μL血清的血样A1-1其总活力为1.68 U，梭子蟹血细胞和血清的蛋白浓度及PO活性见表2～3。

用SPSS软件分析发现，血细胞样本中，市场组（C组）总活力均值为2.67，高于A1、A2、B1、B2各组的活力均值（1.13～1.47之间），差异显著（P<0.05），而A1、A2、B1、B2组之间没有显著性差异（P>0.05）;A1、A2、B1、B2四组比活率分别为0.58、0.38、0.49、0.32，四组相比不存在显著性差异，而C组比活率为2.20，显著低于其他四组（表4）。

3 讨论

本研究结果显示，大豆磷脂组HLS比活率与蛋黄磷脂组HLS比活率接近。市场组HLS比活率高于各试验组，因此认为，饲料中添加足量蛋黄磷脂或大豆磷脂，对于血细胞中PO含量的影响不大。本试验中，试验组血细胞比活率均值显著低于市场组，通过对试验组血细胞的观察计数发现，蛋黄磷脂组颗粒细胞均值和半颗粒细胞均值均显著低于透明细胞数量。在大豆磷脂组中，情况类似，其透明细胞均值显著高于血淋巴中的颗粒细胞数和半颗粒细胞数。因此认为，造成实验室养殖梭子蟹血细胞Apo较低的原因是血液中颗粒细胞和半颗粒细胞数量不足引起的。血清样本中，蛋黄磷脂组比活率略高于大豆磷脂组，但两者均显著高于市场组比活率，本研究结果表明，足量的蛋黄磷脂或大豆磷脂均能显著提高三疣梭子蟹血清中的Apo。

参考文献

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Abstract：Objective  The effect of feed phospholipid level on phenoloxidase activity of crustaceans was studied by taking Portunus trituberculatus which was cultured in laboratory and sold in the market to provide scientific evidence for immunological studies and the development of the Portunus trituberculatus feed production.Method Portunus trituberculatus reach the experimental specifications were randomly divided into A1，A2，B1，B2 four groups（experimental group）.Group A1，A2 for the egg yolk phospholipid group，for feeding group A1，A2 mating feed add sufficient amount of egg yolk phospholipid as phospholipidas source.Group B1，B2 as soybean lecithin group，for feeding group B1，B2 of compound feed，add a sufficient amount of soybean phospholipid as phospholipid source.Farming 8 weeks，from A1，A2，B1，B2 in each group were randomly selected four crab measured serum and HLS Apo，and compared with the serum and HLS Apo of Portunus trituberculatus in the market group（C group）.Result Samples of blood cells，total vitality mean of the market group was 2.67，which was higher than the dynamic mean of each group of the experiment（inter 1.13 to 1.47），and experiments between the groups have no significant difference.The survival rate of A1，A2，B1，B2 was 0.58，0.38，0.49，0.32，respectively，no difference among the four groups，and the market compared activity was 2.20，significantly lower than the experimental groups.Serum samples，the experiment the total vitality value of each group were in the range of 1.40 to 1.99，which did not exist significant differences between the two groups.The survival rate value of group A1，B1，B2 were in the range of 1.97 to 2.68，no significant difference.The average survival rate group B was 4.44，with group A1，B1，B2 had a significant difference.Conclusion As a source of phospholipids，egg yolk lecithin and soybean lecithin on the phenoloxidase activity of HLS from Portunus trituberculatus had no significant impact.The specific activity of serum Apo in the experimental group was significantly higher than that in the market group，to a certain extent，egg yolk lecithin and soybean lecithin could promote phenoloxidase activity in serum.

Keywords：Portunus trituberculatus;phospholipid;non-specific immune;phenoloxidase

（責任编辑 唐建敏）