高效液相色谱法串联质谱法测定禽蛋中恩诺沙星残留量的不确定度评定

王华 刘冬灵 金其扬 蒙丽琼

摘 要：目的：评定高效液相色谱法串联质谱法检测禽蛋中恩诺沙星残留量的不确定度及扩展不确定度。结果：当禽蛋中恩诺沙星含量为6.63μg/kg时，在95%的置信区间下，扩展不确定度为1.2μg/kg（k=2）。结论：实验过程的不确定度主要来源于标准曲线拟合过程和标准溶液配制所产生的不确定度，其次为重复测量和回收率的不确定度。

关键词：高效液相色谱法串联质谱法;禽蛋;恩诺沙星;不确定度

恩诺沙星是第三代喹诺酮药物的一种，是合成抗菌药物，其毒性主要取决于药剂量和动物种类[1-2]。研究证明恩诺沙星在实验动物中显示一定的致突变和胚胎毒性作用[3]。喹诺酮类药物广泛用于兽医临床，已经出现了细菌耐药性，并且在动物源性食品中的喹诺酮残留量容易诱导人类致病菌产生耐药性[4-5]。我国、欧盟、美国、日本等都制定了喹诺酮在各动物组织中最大允许残留限量[6-9]。美国FDA于2005年禁止恩诺沙星作为饲料添加剂用于禽类[10]。我国规定家禽产蛋期禁用恩诺沙星[11]。禽蛋中恩诺沙星的检测方法有液相色谱法、液质法、酶联免疫吸附法[12-15]。测量不确定度表征赋予了被值的分散性，是测量结果的一部分，是符合性判断需要考虑的主要内容之一[16-17]。禽蛋中恩诺沙星的不确定度评定具有非常重要的意义，目前鲜少有报道禽蛋中恩诺沙星残留量的测定的不确定度评定。本文基于GB/T 21312-2007进行禽蛋中恩诺沙星残留量检测的不确定度评定。

1 材料和方法

1.1 试剂与耗材

正己烷、乙睛、甲酸（AR），甲酸、甲醇（色谱纯），14种喹诺酮标准溶液（ANPEL）。

1.2 仪器和设备

安捷伦6410B列安捷伦液相--质谱色谱仪（ESI源）;分析天平：十万分之一天平（赛多利斯ecura225D-1CN），检定允许误差为±0.0001g;电子天平：JJ1000/0.01g～1000g，允差±0.05g;旋涡混合器;离心机;旋转蒸发仪。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

按照称取2.00g禽蛋试样按照GB/T 21311-2007进行样品处理，用2.00mL甲酸--乙睛溶液定容。

1.3.2 色谱条件

XDB-C18色谱柱（4.6×50mm，1.8µm）;柱温35℃;进样量2µL;流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水;流动相洗脱程序：0-1min，80%B;1-7min，80%B线性变至50%B;7-8min，50%B-80%。

1.3.3 质谱条件

离子源：ESI（+）;扫描模式：MRM;干燥气：350℃，45psi，10L/min;毛细管电压：4000V。定量离子对360/342.2，定性离子对360/316.2。

2 结果和分析

2.1 不确定度的来源分析

根据分析步骤，不确定度的主要来源主要有：①样品质量称量（m）;②定容体积（V）;③被测物质量浓度（C）;④测量重复性;⑤回收率。

2.2 不确定度的评定

2.2.1 样品称量的不确定度u（m）

称取2g样品，所用天平最大允许误差为±0.01g，按照矩形分布计算，其标准不确定度和相对标准不确定度分别为：

2.2.2 定容体积产生的不确定度u（v）

样品最后用2mL分度吸量管取V为2mL水溶解蒸残物。

2.2.3 被测物的质量浓度产生的不确定度u（C）

C的不确定度来源有标准系列溶液配制和标准曲线拟合。其中标准系列溶液配制又分为储备液的稀释、标准曲线溶液的配制。

2.2.3.1 标准溶液稀释产生的不确定度u（C-1）

根据标准证书，恩诺沙星标准品的纯度误差为±5%，按照均匀分布计算，由纯度引入的不确定度和相对不确定度分别为：

用1mL单标线吸量管移取儲备液1mL于10mL容量瓶（A级）中，用乙腈定容至刻度，得到质量浓度为10μg/mL的标准溶液（1：10稀释）。按照均匀分布处理，玻璃器具及温度波动引入的不确定度见表1。

2.2.3.2 标准曲线配制过程产生的不确定度u（C-2）

使用20、100、200μL移液器分别移取一定的标准溶液于1mL容量瓶中，用空白禽蛋基质溶液定容至刻度，得到质量浓度分别为1、2、5、10、20、50μg/L的标准系列工作溶液，移液器的刻度误差参考JJG 646-2006《移液器检定规程》的要求，按A类评定，如表2所示。

2.2.3.3 标准工作曲线拟合产生的不确定度u（C-3）

将空白禽蛋基质溶液配制的5种不同质量浓度的标准系列溶液，各取5μL分别重复进样3次，以峰面积（Ai）为纵坐标，标准溶液浓度（Ci）为横坐标，采用最小二乘法拟合而成的线性回归方程为Ai=aCi+b，测定数据及计算结果如表3。取一阳性样品，对各待测化合物浓度C0进行3次重复测定，平均结果为14.7μg/L，则由标准曲线拟合产生的不确定度按（1）式计算：

式中：SR为标准溶液待测物峰面积残差的标准差;a为斜率;b为截距;p为对样品溶液C0的测定次数，p=3;n为标准溶液测试次数，本实验中5个质量浓度重复测定3次，n=5×3=15;Ai为标准溶液各点的待测物的峰面积;Ci为标准溶液各点的待测物的质量浓度;C0为校准方程求得的阳性样品溶液中待测物的质量浓度;为标准溶液的平均质量浓度，;则相对标准不确定度u（C-4）=u（C4）/C0，结果见表4。

3 结论

实验过程中，称量、提取、净化测定等过程均会引入不确定度，本实验通过对质量、体积、实验室温度、玻璃仪器、溶液配制、稀释、重复测定、回收率等因素研究，通过计算，发现标准曲线拟合过程和标准溶液配制所产生的不确定度最大，其次为回收率、测量重复性和体积量取引入的不确定度影响。因此，在实验过程中，认真配制标准曲线，增加平行样品测定，提高实验人员检测的精密性和准确度水平，可达到减小测量不确定度，从而提高检测结果的准确性。

参考文献：

[1]岳振峰，中国检验检疫科学研究院.食品中兽药残留检测指南[M].北京：中国标准出版社，2010.

[2]庞国芳.兽药多组分残留分析技术[M].北京：科学出版社，2016.

[3] Hopper D C，Wolfson J S.Mode of action of the new quinolones：New data. European Journal of Clinical Microbiology，1991，10（4）：223-231.

[4] Kato et al.New Topoisomerase Essential For Chromosome Segregation in E. coli. Cell 63，393-404.Harold C. Neu.The Crisis in Antibiotic Resistance.Science  1992，257（5073）：1064-1073.

[5]Yoshida H ，Kojima T，Yamagishi J.Quinolone-resistant mutations of the gyrA gene of Escherichia coli.Molecular and General Genetics MGG.，1988，211（1）：1-7.

[6]European Commission， Regulation 99/508/EEC of 9th March 1999.Official Journal of European Communities，1999，L60：305.

[7]农业部公告第235号.动物性食品中兽药最高残留限量[S].中华人民共和国农业部，2002.

[8] Federal Register.May 22，1997，62：27944-27947.

[9]《食品中农业化学品残留限量》编委会.食品卷：食品中农业化学品残留限量：日本肯定列表制度[M].北京：中国标准出版社，2006.

[10]FDA：FDA Announces Final Decision About Veterinary Medicine.FDA News， July ，28，2005.

[11] GB 31650-2019.食品中獸药残留最大残留限量[S].北京：国家市场监督管理总局，2019.

[12]农业部781号公告-6-2006.鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量的测定 高效液相色谱法[Z].

[13] GB/T 21312-2007.动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法[S].北京：国家质量监督检验检疫总局，2007.

[14]农业部1025号公告-25-2008.动物源食品中恩诺沙星残留检测 酶联免疫吸附法[Z].

[15]农业部1025号公告-8-2008.动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测 酶联免疫吸附法[Z].

[16] RB/T141-2018.化学检测领域测量不确定度评定 利用质量控制和方法确认数据评定不确定度[S].北京：中国国家认证认可监督管理委员会，2018.

[17] CNAS-TRL-010-2019 CNAS-TRL-010-2019.测量不确定度在符合性判定中的应用[Z].

通讯作者：

蒙丽琼，高级工程师，主要研究方向为食品质量安全。

基金项目：“十三五”北海市海洋经济创新发展示范项目（Bhsfs009）