基于HPLC-LTQ-Orbitrap MS/MS技术的复方鱼腥草合剂化学物质基础表征研究

何厚洪，姚建标，畅文琦，王建方，应 珂，罗婷婷，金汉台，薛 瑾，王如伟*

(1.浙江康恩贝制药股份有限公司，浙江 杭州 310052；2.浙江省中药制药技术重点实验室，浙江 杭州 310052；3.浙江康恩贝中药有限公司，浙江 丽水 323400)

复方鱼腥草合剂由鱼腥草、黄芩、板蓝根、金银花、连翘五味中药组成，在临床上主要用于外感风热引起的急性咽炎、扁桃腺炎。截至目前，部颁标准中复方鱼腥草合剂的含量测定仅以黄芩苷作为指标，而复方中成药具有多成分、复杂的特点，单一指标已不足以全面反映和控制合剂的质量。目前，对于复方鱼腥草的质量研究多为单一或少数几个指标，如黄芩苷、连翘苷、绿原酸等的HPLC含量测定[1-2]或指纹图谱研究[3]，缺乏对复方鱼腥草合剂整体化学物质基础的系统研究。

为了快速系统鉴定复方鱼腥草合剂中的化学物质成分，本研究采用HPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS技术对复方鱼腥草合剂进行定性分析，快速鉴别复方鱼腥草中的化学成分，并对鉴定出的成分进行药味与大类成分的归属，为提升复方鱼腥草合剂的质量标准及药理作用机制的研究提供基础和方向。

1 材料

1.1 仪器

戴安 UltiMate 3000超高效液相-轨道质谱联用仪，包括在线脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱、可变波长检测器以及ESI离子源。

1.2 药材与试剂

甲醇(色谱纯，Merck)；甲酸(色谱纯，百灵威)；试验用水为Milli-Q系统制备(电阻率18.2 MΩ，25 ℃)。对照品黄芩苷(批号110715-201821)、汉黄芩苷(批号112002-201702)、汉黄芩素(批号111514-201706)、连翘酯苷A(批号111810-201707)、连翘酯苷B(批号111811-201603)、当药苷(批号111742-200501)、异槲皮苷(批号111809-201804)、绿原酸(批号110753-201817)、金丝桃苷(批号111521-201809)、槲皮苷(批号111538-201606)、连翘苷(批号110821-201816)均购自中国食品药品检定研究院。鱼腥草(批号Z001a-180301)、黄芩(批号1804004)、板蓝根(批号Z003c-180401)、金银花(批号1803002)、连翘(批号Z004b-180301)、复方鱼腥草合剂(批号B181001)均由浙江康恩贝中药有限公司提供。

2 方法

2.1 色谱质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱：0～5 min，5%B；5 ～10 min，5% B→20% B；10～20 min，20% B→ 30% B；20～30 min，30% B→38% B；30～38 min，38% B；38～60 min，38% B→55% B；60～65 min，55% B→65% B；65～66 min，65% B→95% B；66～70 min，95% B。然后接着运行10 min；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.1.2 质谱条件 离子源温度：350 ℃(±)；鞘气流速：40 arb(+)，35arb(-)；保护气流速：10 arb(±)；尾吹气流速：0 arb(±)；喷雾电压：3.2 kV(±)；毛细管温度：325 ℃(+)，300 ℃(-)。所有样品数据采集均采用全扫描模式，分辨率为 60 000 FWHM。一级全扫描质量数范围m/z 120～1 200；二级采用数据依赖性扫描，设置阈值1 000以上的母离子作为扫描对象，动态排除时间设为15 s，重复扫描次数设为 2次，重复扫描时间设为15 s，碰撞诱导解离电压为35 V。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、连翘酯苷A、连翘酯苷B、当药苷、异槲皮苷、绿原酸、金丝桃苷、槲皮苷、连翘苷对照品适量，加甲醇制备终浓度均约为50 μg·mL-1的混合对照品溶液，置于4 ℃冰箱备用。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取药材鱼腥草2 g、黄芩2 g、板蓝根2 g、金银花2 g和连翘2 g，分别置于100 mL锥形瓶中，加水煎煮2次，合并煎煮液，减压浓缩至密度约为1.2，加入适量86%乙醇至药液中酒精含量为70%，醇沉静置过夜，药液过滤后减压浓缩至无醇味，置于4 ℃冰箱保存。临用前用纯水稀释10倍，滤过，取续滤液，即得各药材供试品溶液。将复方鱼腥草合剂直接滤过，取续滤液，即得合剂供试品溶液。

3 结果

采用建立的HPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS方法对复方鱼腥草合剂进行了分析，其正负离子模式下的总离子流见图1。

图1 复方鱼腥草合剂正负离子模式下总离子流

根据正负离子模式下的一级质谱，确定其分子离子峰，在此基础上，进一步分析其二级碎片信息，可推断化合物的部分结构。最后比较对照品的色谱质谱行为，确认化合物。若无相应对照品，还需要比对合剂与各药材的总离子流图，先确认峰归属，再通过pubmed、hmdb、massbank等化学数据库以及对应药材的相关文献[4-17]推断最有可能的化合物。最终从复方鱼腥草合剂中归属了107个化学成分，其中包括7个氨基酸，11个苯乙醇苷，3个核苷，11个环烯醚萜，39个黄酮、12个木脂素、8个生物碱、14个有机酸，另有2个辅料峰。进一步对化合物进行药味归属，最终在鱼腥草中归属了22个，黄芩中40个，板蓝根中27个，连翘中31个，金银花中32个，部分化合物存在于多味药材中。各化合物的基本信息见表1。

表1 复方鱼腥草合剂化学物质基础表征

(续表1)

(续表1)

(续表1)

从归属结果看，部分化合物来源与药材也具有一定的对应性。如黄酮主要来源于黄芩，环烯醚萜主要来源于金银花，苯乙醇苷主要来源于连翘等，这些化合物普遍具有抗炎、抗菌、抗氧化、增强免疫等药理活性[18-20]，以下为该三类特征化合物的基本裂解模式。

3.1 黄酮类化合物

从复方鱼腥草合剂中共鉴定出黄酮类成分39个，其中黄酮苷的二级质谱图具有特征性，一般呈现出较高的苷元的信号响应。例如黄芩苷(83)分子离子[M+H]+为447.091 4，负离子模式下的一级谱中还可见[2M-H]-m/z 891.157 8与源内裂解产生的苷元信号m/z 269.044 6。通过Xcalibur软件推断可能的分子式为C21H18O11，偏差在5 ppm以内。在二级质谱图中可见m/z 269.045 4 [M-178-H]-，可能为脱去一分子葡萄糖醛酸，结合对照品比对确认该峰确为黄芩苷。黄酮苷元则可能发生RDA裂解，产生特征的碎片离子，如白杨素(104)分子离子[M+H]+为255.065 7，[M-H]-为253.050 5，根据精确分子量推测化学式为C15H10O4。在二级质谱图中可见m/z 153.018 5 [M-C8H6+H]+，为黄酮苷元发生RDA裂解产生的1，3A+碎片。

(a)黄芩苷(b)白杨素

3.2 环烯醚萜类化合物

从复方鱼腥草合剂中共鉴定出环烯醚萜类成分11个，主要来源于金银花。以马钱苷酸(22)为例，其分子离子[M+Na]+为399.125 8，[M-H]-为375.129 6，根据精确分子量推测分子式为C16H24O10。二级质谱图中可见m/z 213.076 7为 [M-162-H]-，结构中可能存在一分子六碳糖，m/z 169.087 1母核脱去CO2，m/z 151.0764为进一步脱去一分子水。结合文献报道，推测该化合物为马钱苷酸，而另一个同分异构体为7-epi马钱苷酸。

3.3 苯乙醇苷类化合物

从复方鱼腥草合剂中共鉴定出苯乙醇苷类成分11个，主要来源于连翘。以连翘酯苷A(51)为例，其分子离子[M+Na]+为647.194 6，[M-H]-为623.194 6，根据精确分子量推测分子式为C29H36O15。二级质谱图中可见m/z 461.165 6为[M-C9H8O3-H]-，m/z 443.155 9为[M - C9H8O3-H2O-H]-，推测结构中含有一分子六碳糖，另可见m/z 315.108 5的二羟基苯乙醇苷母核碎片。结合对照品比对，确认该峰确为连翘酯苷A。

图3 环烯醚萜类成分典型裂解模式示例

4 讨论

中药具有疗效好、成本低、相对低毒性的特点，但其复杂的化学成分及药效物质不明确致使中药质量控制与药理机制研究困难重重，因此对中药及其相关制剂进行全面的化学表征非常必要，对于明确药效物质基础及其作用机制研究意义重大。随着质谱技术的发展，实现高效准确的复杂体系快速分析成为可能，通过化合物的质谱一级、二级信息，可快速获取其结构信息，同时结合庞大的数据库还可以探索未知成分、挖掘中药中潜在的有效物质。色谱-质谱联用技术应用于化合物结构鉴定可为中药多组分鉴定研究提供更可靠的依据。

本研究通过建立HPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS方法，初步鉴定了复方鱼腥草合剂中107个化合物，首次系统明确了复方鱼腥草合剂的整体化学物质基础，实现了对复方鱼腥草合剂成分的快速定性分析，且该方法快速、简便、灵敏度高。此外，药味归属的结果反映了合剂中各药材的特征性成分，如槲皮苷(鱼腥草)、9(S)，10(S)，11(R)-三羟基-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸(板蓝根)、连翘苷(连翘)、黄芩苷(黄芩)、獐芽菜苷(金银花)等，对合剂质控指标的筛选和质量标准的提升具有重要作用，为弥补复方鱼腥草合剂单一检测指标的不足提供依据。通过结合相关化合物的药理活性报道，可以侧面反映复方鱼腥草合剂抗炎、抗菌等作用，对于合剂药效物质基础的阐明也具有重要意义。

图4 苯乙醇苷类成分典型裂解模式示例