冷藏真空包装金鲳鱼片复合生物保鲜剂配方优化

于淑池，林美君，王睿迪，裴志胜，杨波

（1.海南热带海洋学院海南省海洋食品工程技术研究中心，海南三亚572022；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

金鲳鱼（golden pompano）学名卵形鲳鲹，地方名称黄腊鲳，金鲳，属硬骨鱼纲、鲈形目、鲳鲹属[1]，其鱼肉细嫩，味道鲜美，营养丰富[2]，是我国海南、广东沿海重要的海产经济鱼类之一[3]。目前金鲳鱼保鲜多采用冻藏[4]，随着消费观念的转变，人们越来越关注水产品的新鲜度[5]，通过低温（0℃～4℃）贮藏的鱼肉与新鲜鱼肉的品质更为接近，更受到消费者的青睐[6]。而低温冷藏下卵形鲳鲹的货架期太短[7]，极大地限制了卵形鲳鲹的流通和加工，而现有的冷藏保鲜方法如物理法因成本较高不能被广泛应用；化学保鲜法则会引起微生物的耐药性及化学物质残留等副作用；生物保鲜技术因其具有天然、安全、方便等优点，已成为水产品贮藏保鲜的研究热点[8]。生物保鲜剂可以分为动物源、植物源和微生物源保鲜剂[9]。壳聚糖（chitosan）作为动物源保鲜剂目前应用比较广泛，是甲壳素脱N-乙酰基的产物，具有很强的抑菌效果[10-11]；茶多酚（tea polyphenols）是茶叶中多酚类物质的总称，也称抗氧灵，安全无毒，且具有明显的抗菌、抗氧化作用，也可以抑制微生物的生长繁殖[12-14]，是一种具有推广价值的天然保鲜剂[15]；ε-聚赖氨酸（ε-L-polylysine，ε-PL）是微生物分泌的天然广谱性抑菌物质，具有抑菌、安全、无毒、稳定性强诸多优点，已被广泛用作食品防腐剂[16]，ε-聚赖氨酸盐酸盐是一种营养型生物保鲜剂，具有良好的保鲜性能。

复合生物保鲜剂是将具有不同功能或来源的保鲜剂协同使用，形成一种高效的复合保鲜剂，可以大大提高水产品的保鲜效果[17-19]。

目前金鲳鱼的生物保鲜研究报道较少，仅有杨坤等[20]研究了表没食子儿茶素没食子酸酯对冷藏金鲳鱼鱼片保鲜品质的影响；林晓霞等[21]研究了番石榴多酚可以显著延长金鲳鱼糜的货架期，具有良好的保鲜效果；张涵等[22]研究了聚赖氨酸（ε-PL）与海藻酸钠复合成膜，协同气调包装对金鲳鱼冷藏保鲜作用；将不同生物来源的保鲜剂进行复配，探究复合生物保鲜剂对真空包装冷藏金鲳鱼片的保鲜效果的研究尚未见报道。

本研究以冷藏金鲳鱼片为研究材料，以感官评价，菌落总数，挥发性盐基氮为指标，优化茶多酚、壳聚糖、ε-聚赖氨酸盐酸盐对冷藏金鲳鱼片保鲜的最佳配方并进行应用验证。旨在为金鲳鱼的加工保鲜提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

金鲳鱼：（600±15）g，海南三亚市胜利路旺豪超市。

ε-聚赖氨酸盐酸盐（食品级）：浙江新银象生物工程有限公司；茶多酚（食品级）：河南千志商贸有限公司；壳聚糖（食品级）：河南通宇食品化工有限公司；硼酸、氯化钠、盐酸、95%乙醇、营养琼脂：均为分析纯，西陇科学股份有限公司；氧化镁（分析纯）：上海强顺化学试剂有限公司；甲基红、次甲基兰：均为分析纯，天津市天新精细化工开发中心。

N5000型质构仪：上海佑科仪器仪表有限公司；MesoMR23-060H-1型核磁共振成像分析仪：苏州纽迈分析仪器股份有限公司；ME204E/02型电子天平、SG8型精密pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DZ-500/1s型真空包装机：浙江温州市达丰机械有限公司；DS-150型恒温恒湿试验箱：苏州市易维试验仪器有限公司；J-2型菌落计数器：江苏天翎仪器有限公司；FOSS Kjeltec8400型全自动凯氏定氮仪：丹麦FOSS中国上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金鲳鱼保鲜处理的工艺流程

鲜活金鲳鱼→敲头致死→清洗表面黏液→预处理（去头、去内脏）→剖半片鱼[（60±0.1）g]→保鲜剂冰浴浸泡1 h[鱼片与处理液料液比为1∶2（g/mL）]→取出沥干→真空包装→4℃冰箱冷藏→检测相关指标

1.2.2 正交试验

根据GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[23]，水产品中允许添加的茶多酚、壳聚糖和ε-聚赖氨酸盐酸盐的最高用量分别为0.3、6.0、0.3 g/kg，由预试验可知，单一生物保鲜剂对金鲳鱼片的保鲜效果显示：茶多酚用量为0.2 g/kg，壳聚糖用量为4.0 g/kg，ε-聚赖氨酸盐酸盐用量为0.25 g/kg保鲜效果最好，对每个因素选取3个水平，选用L9（33）正交试验，以感官评分、菌落总数、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值作为评价指标，真空包装4℃冰箱冷藏10 d，最终分析确定最佳复合保鲜剂配方。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal experiment factor level

1.2.3 应用试验

对最优复合保鲜剂进行应用验证，以菌落总数、感官评分、TVB-N值作为主要指标，pH值、质构分析、低磁场核磁分析技术为辅助指标，以空白组（未经保鲜剂处理）为对照，测定真空包装4℃冷藏14 d各指标的变化情况，探究最优复合保鲜剂对金鲳鱼片的保鲜效果。

1.2.4 各指标测定方法

1.2.4.1 感官评定

感官评定采用GB/T 18108-2008《鲜海水鱼》的方法[24]，评定人员由固定10人组成，以色泽、气味、组织形态、组织弹性为评定项目，每个评定项目满分分别为25分，总分100分，80分～100分品质最好，40分作为可接受界限，40分以下则不能食用，20分以下品质最差。

1.2.4.2 菌落总数测定

菌落总数测定参照GB/T4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》的方法[25]。

1.2.4.3 挥发性盐基氮（TVB-N）测定

参照GB/T 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中半微量扩散法[26]。

1.2.4.4 pH值的测定

按照GB/T5009.237-2016《食品安全国家标准食品中pH值的测定》方法[27]。

1.2.4.5 质构分析

测量参数包括硬度、咀嚼力和弹性。取金鲳鱼片背部靠近脊骨处的鱼肉，采用质构剖面分析（texture profile analysis，TPA）测量模式，预测试速度 3 mm/s，测试速度1 mm/s，返回速度5 mm/s，触发点负载5 g，目标2.0 mm，力量感应元大小为1 000 N，探头升高距样品表面20 mm，形变量50%，起始力0.9 N[28]。

1.2.4.6 低磁场核磁分析

应用纽迈台式脉冲核磁共振分析仪（nuclear magnetic resonance，NMR）进行NMR自旋，并测量自旋弛豫时间（T2）。取质量约10g的金鲳鱼肉放入直径60mm的核磁管中。测试参数：分析磁体线圈60 mm，测量温度 32 ℃，起始脉冲宽度 1.0 μs，结束脉冲宽度 36.0 μs，累加步长 1.0 μs，射频信号频率主值22 MHz，射频信号频率偏移量840 152.79 Hz，重复采样间隔时间2 500 ms，90°脉宽 13 μs，80°脉宽 26 μs，采样点数1 024，采样频率 200 kHz，回波时间 300 μs，回波个数5 000，重复采样4次，采样起始点控制参数80 μs，迭代次数100 000。

1.3 数据处理

Excel作图，Origin 2017（Origin Lab Corp.LTD）绘制弛豫信号曲线图，显著性差异采用Duncan多重比较检验分析（P＜0.05），试验结果以平均值±标准偏差来表示。

2 结果与分析

2.1 正交试验的结果

按照表1的因素水平设置进行正交试验，结果见表2。

表2 正交试验结果分析Table 2 Analysis table of orthogonal experiment results

由表2可知，从感官评分、菌落总数、挥发性盐基氮3个指标的极差分析结果来看，3种保鲜剂的影响顺序均为A（茶多酚用量）＞C（ε-聚赖氨酸盐酸盐用量）＞B（壳聚糖用量）；从感官评分指标分析，因素的最优水平组合为A3B2C1或A3B2C2，保鲜效果等同最佳；菌落总数指标最优水平组合为A2B2C3；挥发性盐基氮值的最优水平组合为A2B1C3；而感官评分的最优组合A3B2C1是正交试验的第8组（实际最优组），因此将其他3个最优水平组合进行为期10 d的验证试验，每组试验重复3次，取平均值，结果见表3。

表3 正交试验最优水平组合验证试验结果Table 3 Verification test results of optimal horizontal combination of orthogonal experiments

从表3可以看出，菌落总数、挥发性盐基氮的最优水平组合与感官评分组合相比，验证测得的3个指标值感官评分总体偏低；菌落总数和挥发性盐基氮值较高，揭示这两个组合的保鲜效果一般；感官评分组合A3B2C2验证试验结果显示，感官评分与表2的第8组A3B2C1一致，菌落总数略有升高，而挥发性盐基氮指标较低，显示A3B2C2组合保鲜效果优于正交试验第8组A3B2C1，因此确定A3B2C2（即茶多酚用量0.25 g/kg、壳聚糖用量4 g/kg、ε-聚赖氨酸盐酸盐用量0.25 g/kg复配）为最优组合配方。

2.2 复合保鲜剂最优配方的应用试验结果

2.2.1 复合保鲜剂处理对真空包装冷藏金鲳鱼片感官品质的影响

复合保鲜剂处理后，冷藏期间金鲳鱼片感官品质的变化结果见图1。

图1 真空包装金鲳鱼片冷藏期间感官品质的变化Fig.1 Changes in sensory quality of vacuum packed golden pompano fillets during cold storage

从图1中可以看出，两个处理组随着时间的推移，感官评分逐渐下降，空白对照组在第10天完全劣变，感官已无法接受（感官评分34分＜40分临界点），有刺激性氨味产生，体表无光泽，有油脂渗出，鱼脂大块脱落，组织纤维松散症状；复合保鲜剂组仍有较清淡的鱼腥味，鱼脂紧贴体表，组织纤维致密，第14天时感官评分为40分，达到可接受界限。

2.2.2 复合保鲜剂处理对真空包装冷藏金鲳鱼片菌落总数的影响

冷藏期间金鲳鱼片菌落总数的变化结果见图2。

图2 真空包装金鲳鱼片冷藏期间菌落总数的变化Fig.2 Changes in aerobic plate count of vacuum packed golden pompano fillets during iced storage

水产品在贮藏过程中容易受到微生物污染而引起品质下降，菌落总数是很多国家检测水产品品质的一个常规指标[29]。从图2中可以看出，两个处理组随着时间的推移，菌落总数逐渐上升，复合保鲜剂组总体低于空白组，显示具有较强的杀菌和抑菌作用。GB 18406.4-2001《农产品安全质量无公害水产品安全要求》规定细菌总数应不大于6lg（cfu/g），以此判断水产品货架期终点，空白对照组在第8天时[6.89 lg（cfu/g）]已经超出货架期，而复合保鲜剂组在第12天时 [6.73 lg（cfu/g）]才超出货架期。

2.2.3 复合保鲜剂处理对真空包装冷藏金鲳鱼片挥发性盐基氮指标的影响

冷藏期间金鲳鱼片挥发性盐基氮指标的变化结果见图3。

图3 真空包装金鲳鱼片冷藏期间挥发性盐基氮的变化Fig.3 Changes in TVB-N of vacuum packed golden pompano fillets during iced storage

按GB 2733-2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》[30]规定，挥发性盐基氮值（TVB-N）应该不超过30 mg/100 g，海水鱼一般TVB-N≤15 mg/100 g为一级鲜度，TVB-N≤30 mg/100 g为二级品。从图3中可以看出，两个处理组随着时间的推移，TVB-N逐渐上升，复合保鲜剂组总体低于空白对照组，与菌落总数和感官品质的变化规律基本相符，空白对照组在第10天时TVB-N在28.76 mg/100 g，接近二级品，随后逐渐腐败；复合保鲜剂组14 d时的TVB-N值为29.56 mg/100 g，接近二级鲜度终点，远低于空白对照组。空白对照组在 5 d～6 d时超出一级鲜度（＞15 mg/100 g），复合保鲜剂组则在9 d～10 d时超出一级鲜度；空白对照组货架期（超过30 mg/100 g）约为10d～11d，复合保鲜剂组货架期则为14d～15d，一级鲜度和货架期均比空白对照组延长4 d左右。

2.2.4 复合保鲜剂处理对真空包装冷藏金鲳鱼片pH值的影响

冷藏期间金鲳鱼片pH值的变化结果见图4。

图4 真空包装金鲳鱼片冷藏期间pH值的变化Fig.4 Changes in pH value of vacuum packed golden pompano fillets during cold storage

鱼体死后，pH值变化是先下降后升高，下降是因为体内糖原降解，乳酸积聚，升高是因为体内蛋白质及其他含氮有机物分解产生氮和氨等碱性物质。从图4可以看出，复合保鲜剂能有效抑制糖原的分解和乳酸的积聚，因此在第2天和第4天时pH值高于对照组，随着贮藏时间的增加，蛋白质等物质开始分解，复合保鲜剂在一定程度上抑制了蛋白质等物质的分解，且随着时间的增加抑制效果越明显。因此在第6天以后，pH值低于对照组；且随着贮藏时间的增加，两者差距逐渐增大。

2.2.5 复合保鲜剂处理对真空包装冷藏金鲳鱼片质构指标的影响

复合保鲜剂处理对真空包装冷藏金鲳鱼片质构指标的影响情况见表4。

表4 真空包装金鲳鱼片冷藏期间质构指标的变化Table 4 Changes in texture index of vacuum packed golden pompano fillets during cold storage

质构测定指标包括硬度、弹性及咀嚼力，一般数值越大说明鱼肉质地越好[17]。鱼体死后，随着糖原的分解和乳酸的积聚，腺苷三磷酸（adenosine trip-hosphate，ATP）的活跃，硬度会逐渐上升，即僵硬期；由于鱼体内微生物的大量繁殖，引起腐败变质从而导致蛋白质空间结构遭到破坏[31]，随着含氮物质的分解，硬度会下降，出现软化等。弹性和咀嚼力是评价肉口感的两个指标，由表4可以看出，复合保鲜剂组的硬度、弹性和咀嚼力都高于空白组（P＜0.05），说明复合生物保鲜剂处理，能够抑制金鲳鱼片质构特性的改变，有着优于对照组的质地和口感。

2.2.6 低磁场核磁共振（low-fieldnuclear magnetic resonance，LF-NMR）测定金鲳鱼片水分变化结果

利用低磁场核磁分析不同贮藏时间下金鲳鱼肌肉组织内不同水分分布，来推测复合保鲜剂的保水效果，并与不做处理的空白对照组相比较，不同贮藏时间低磁场核磁共振（LF-NMR）横向弛豫时间T2的反演情况见图5。

图5 真空包装金鲳鱼片冷藏期间横向弛豫时间的变化Fig.5 Changes in transverse relaxation time of vacuum packed golden pompano fillets during cold storage

LF-NMR反演后的弛豫图有3个峰，区间分别处于T21（1 ms～10 ms）、T22（10 ms～100 ms）和T23（100 ms～1 000 ms），反映出鱼肉中水分存在的3种状态，T21为蛋白质分子表面的极性基团与水分子紧密结合的结合水；T22代表肌肉中存在于肌纤丝、肌原纤维及细胞膜之间的不易流动水；T23表示存在于细胞外间隙中可自由流动的水。其中T22代表鱼肉网状结构中水分的滞留能力，含量一般在90%左右，占肌肉中水分的绝大部分，为水分的主要存在形式。图5显示，复合保鲜剂组和空白对照组T22总体变化趋势是贮藏初期峰较高，6 d～8 d有所下降，10 d后有所上升，后期基本趋于平稳（对照组的第14天时T22峰较高，可能因为对照组在10 d时已经腐败变质，导致14 d测量结果可能有些偏差），比较而言，复合保鲜剂组的T22峰值普遍高于空白对照组，显示出较好的保水效果。T21、T22、T23各峰与横坐标面积的百分比可以代表水分含量（以A21、A22、A23来表示），峰面积的差异代表不同状态水的比例[32]，其中不易流动水A22所占比例越大则样品的保水性越好。金鲳鱼片冷藏期间水分含量的变化结果见表5。

表5 真空包装金鲳鱼片冷藏期间水分含量的变化Table 5 Changes in moisture content of vacuum packed golden pompano fillets during cold storage

从表5中可以看出，复合保鲜剂组和空白对照组A22总体变化趋势是第4天稍有升高，8 d左右下降，后期有所上升，但基本趋于平稳，而且复合保鲜剂组的A22水分含量总体高于空白对照组，自由水A23含量低于对照组，说明复合保鲜剂具有较好的保水能力。袁乙平等[33]采用低磁场核磁共振技术研究牦牛肉经真空包装后于4℃贮藏过程中水分的变化时发现，T22、T23峰面积不断减少，说明不易流动水和自由水随着贮藏时间的延长不断减少，与本研究结论相似，只是本研究复合保鲜剂组10 d后水分含量A22总体变化趋于平稳，下降趋势不明显，A23总体低于对照组，说明复合保鲜剂组具有较好的保水性能，减少了不易流动水向自由水的流失。

3 结论

通过正交试验，确定了复合保鲜剂的最优配方为茶多酚用量0.25 g/kg、壳聚糖用量4 g/kg、ε-聚赖氨酸盐酸盐用量0.25 g/kg复配。最优复合保鲜剂处理后可以延缓金鲳鱼的腐败变质，能将4℃真空包装金鲳鱼片的一级鲜度和货架期均延长4 d左右；硬度、弹性、咀嚼力明显升高；低磁场核磁显示，复合保鲜剂的保水性能显著优于对照组。因此，本研究所得复合保鲜剂最优配方可以应用于金鲳鱼及其它水产品的贮藏保鲜。