脂肽类生物表面活性剂研究概况

蔡京荣 吕佳佳

（阳煤丰喜泉稷能源有限公司，山西运城，043200）

脂肽类生物表面活性剂是由Aaima等于1968年首次在枯草芽孢杆菌的代谢物中发现[1]。随后人们对脂肽展开了广泛研究，脂肽类物质通常为混合物，其化学机构中包含非极性疏水基和极性亲水基，二者以化学键连接，结构不对称，具有较强的极性，水油两亲，可大幅降低表面和界面张力[2]，随着研究深入，人们发现脂肽还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、杀虫等多种生物功能[3]，在食品工业、石油工业、农业、医药工业等领域具有广阔的应用前景。

由于分离纯化难度大、生产成本高等因素的制约，绝大多数脂肽尚处于实验室研究阶段，目前的主要研究集中在化学结构的鉴定方面。因此，挖掘新型高效的脂肽类物质，使其充分发挥其多元化的功能，具有重要的科学意义和实际应用价值。

国际上对脂肽有关理论和应用的研究已开展多年，国内有关研究整体上仍处于起步阶段，本文从化学结构、理化性质、分离和纯化、主要应用、研究现状等方面对脂肽的研究概况作出综述，以期为相关研究提供借鉴。

1 脂肽的结构和性质

1.1 化学结构

脂肽类生物表面活性剂（LBS）一般经过两个步骤生成，首先由非核糖体肽合成酶直接识别、缩合氨基酸而形成亲水性肽链，然后生成的肽链与疏水性脂肪酸链连接为脂肽。由于肽链和脂肪酸种类繁多，结构复杂，所以脂肽的种类和结构具有丰富的多样性。目前，多数报道的脂肽以环状和线性两种结构为主[4]。

1.1.1 环状脂肽

根据脂肪酸链与肽链的成环、接环以及离环的连接方式可将环脂肽分为3种类型。其中，脂肪酸的羟基或氨基与肽链氨基酸的C-端连接，脂肪酸的羧基与氨基酸N-端连接，共同组成了脂肪酸成环的环脂肽[5]；由于脂肪酸成环的位置的不同又可细分为β-羟基脂肪酸成环的环脂肽、β-氨基脂肪酸成环的环脂肽和α-氨基脂肪酸成环的环脂肽。

（1）β-羟基脂肪酸成环的环脂肽

β-羟基脂肪酸成环结构的典型代表是莎梵婷系（Surfactins）脂肽。脂肪酸链上的碳原子和β-羟基与7个氨基酸的肽链以内酯键组成环状结构。主要包括莎梵婷、地衣素、短小酸素和Kannurin等脂肽类化合物。

（2）β-氨基脂肪酸成环的脂肽

β-氨基脂肪酸成环结构的典型代表是伊枯草菌素系，包括杆菌肽素、抗霉枯草菌素、伊枯草菌素、杆菌霉素等。Iturins是由7肽与含C14～C17的β-氨基脂肪酸链通过酰胺键相连而成的一类环脂肽。

（3）α-氨基脂肪酸成环的脂肽

典型的α-氨基脂肪酸的环状脂肽有环状四肽（Trapoxins）A和B，可阻碍NIH3T3细胞转化，起到抗肿瘤作用。

1.1.2 线性脂肽

线形脂肽指氨基酸顺次连为线形、首尾不相接且不存在环状结构的脂肽。如产紫晶链孢囊菌亚种发酵液中发现的TAN 1511（A～C）[6]；由螺旋鱼腥藻分泌的螺旋形素。

1.2 脂肽的性质

1.2.1 理化性质

目前，在脂肽类生物表面活性剂中研究较多的是表面活性素（Surfactin）， 它是目前已发现的生物表面活性剂中表面活性最强的一种，CMC仅为25 mg/L，但可将水的表面张力降至27 mN/m，可将水/十六烷的界面张力降至1 mN/m。枯草芽孢杆菌BS5产生的Surfactin，在pH＞5时就可溶解于水，也可溶解于乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、氯仿等有机溶剂，于100℃加热1 h仍具有良好的稳定性。

李蔚等[7]用地衣芽孢杆菌株产生的一种脂肽类表面活性剂，其CMC为30.0 mg/L，可耐高温和高浓度盐，pH适应范围较广，对原油具有较强的乳化、增溶、脱附和降黏作用。

尹华等[8]由假单胞菌XD-1菌株所产生的表面活性剂为脂肽类和糖脂类混合物，其CMC为50 mg/L，在pH=6.0时表现出最佳活性。

1.2.2 生物活性

（1）抗菌活性

脂肽对革兰氏阳性、阴性菌和真菌均具有高效广谱的杀菌作用。自2003年至今，已有有十多种脂肽抗生素参与临床研究或上市。例如Polymixin，一种具备抗内毒素活性的特异性药物，是临床上治疗严重感染泛耐药鲍曼不动杆菌和假单胞菌的特效抗生素，用于预防医院重症监护病房及血液病房等区域交叉感染疾病的发生，可被囊性纤维患者经静脉注射或经雾化吸入来防治呼吸道感染[9]。

（2）抗支原体

脂肽具有抗支原体作用，可用于疫苗及免疫调节分子等方面。例如 Surfactin与细胞膜上磷脂和胆固醇具很强的亲和力，所以具有丰富磷脂和胆固醇的支原体比哺乳动物细胞对Surfactin更敏感[10]，因此Surfactin对支原体的繁殖有很强的抑制作用，在临床上与常规抗原混合使用起到抗支原体的功效。

（3）抗炎活性

脂肽具有抗炎作用。例如Surfactin能选择性的抑制非洲绿猴肾上皮细胞磷脂酶A2的活性，抑制了炎症介质花生四烯酸的释放，阻止炎症的发展。

Taichi等[11]研究发现，Surfactin C1能够选择性的抑制脂多糖信号的转导，可以作为一种潜在的药物来源，用来治疗由脂多糖诱发的疾病，如革兰阴性菌白血病和牙周炎等。

（4）抗病毒活性

脂肽可与病毒脂包膜的相互作用，进而破坏病毒的结构，对DNA 病毒、传染性法氏囊病毒、疱疫病毒或者逆转录酶病毒等具有直接灭活作用。

例如Surfactin对单纯疱疹病毒、鼠脑心肌炎病毒、疱疹性口炎病毒、猿免疫缺陷病毒、猪细小病毒等病毒表现出不同程度的抑制效果[12]，对伪狂犬病病毒和新城疫病毒具有直接抑制效果。

（5）抗肿瘤活性

脂肽能够破坏肿瘤细胞的线粒体膜，激活半胱天冬酶从而诱导细胞凋亡，进而表现出抗肿瘤的活性，对人乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞和直肠癌细胞具有杀伤作用[13]。

Lee等[14]研究发现，Surfactin对癌细胞具有特异的杀伤作用，但不伤害正常活体细胞。

Wang等[15]研究发现脂肽能够使肿瘤细胞静止在G1期，诱导肿瘤细胞凋亡，对人白血病细胞（K562）表现出杀伤作用。

2 脂肽的生物合成、分离纯化和结构鉴定方法

2.1 脂肽的主要生产菌种

自然界中酵母菌、真菌、细菌等多种微生物都可以产生脂肽，目前已发现的主要有隐杆菌属、类芽孢杆菌属 、梭菌属、游动放线菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、镰孢霉属、链霉菌属、节杆菌属、分支杆菌属、短杆菌属和解硫胺素芽孢杆菌属[16-22]等，包含陆地和海洋微生物。

2.2 脂肽的生物合成

Grangemard等[23]最早研究了枯草芽胞杆菌产生脂肽的机制，随后有关研究陆续展开，人们发现，与脂肽类物质化学结构的多样性相反，各种脂肽的生物合成机制基本上是由独立合成的肽和脂质部分的缩合产生，以环脂肽为例，简述如下：

环脂肽是由非核糖体肽合成酶（NRPS）复合体以非核糖体多肽的方式催化合成。NRPS是多模块酶识别，每个模块允许在一个特定的肽部分氨基酸的掺入，从而激活，修饰和链接氨基酸中间体到产生的肽[24]。典型的模块域包括腺苷化结构域、巯基化功能域、缩合功能域和硫酯酶结构域4部分。合成酶在模块上有效分部，每个模块依次将相应氨基酸组合到多肽链中。所以非核糖体多肽化合物的结构多样化往往伴随着重要的生物学活性。

2.2.1 肽段的生物合成

具有氨基酸激活功能的A结构域从底物中结合特定的氨基酸，由底物氨基酸的腺苷酸反应激活转化为氨酰腺苷酸，然后氨酰酰苷酸与T结构域的磷酸泛酰巯基辅基的巯基以共价方式结合形成硫酯键，组成后的氨酰-S-载体复合体上的氨基与C结构域的肽酰基的酰基进行亲核反应，形成新肽键，延长了一个氨基酸的肽酰载体复合物进入下一个肽酰形成的反应。在完成肽链的延伸后，TE域终止合成肽链，将肽链释放下来，并进行环化。

2.2.2 脂质体部分的生物合成

脂肽脂质部分的生物合成是由数个模块耦合来完成，对肽链的脂肪酸键进行活化。Marahiel等学者将其归纳为5个步骤[25]，首先，域的酰基辅酶A连接酶耦合的辅酶A脂肪酸。活性脂肪酸后，转移到第一个域的酰基载体蛋白辅因子，同时，一个丙二酰辅酶A固定到ACP2域。丙二酰基硫酯的催化酮的缩合合成酶结构域导致一酮酯的形成。酮酯转化为氨基酸的转氨基脂肪酸。氨基脂肪酸可以通过缩合结构域转移到硫醚化域。它可以连接到一个氨基转移酶的固定肽部分的氨基酸生物合成的第一个模块。最终实现合成、脂肽可修改特定酶的糖基化或卤化的合成酶相关。

表1 部分脂肽的分离纯化方法

2.3 脂肽的分离纯化和结构鉴定

对脂肽的分离纯化，通常采用浓H C l 或(NH2)2SO4沉淀得脂肽粗提物，再通过薄层层析、凝胶色谱层析、反向高效液相（HPLC）等技术手段进一步分离纯化[26]。

最早研究脂肽各肽片段的组成及顺序往往通过Edman 酶解法和氨基酸分析仪[27]。随着分析技术的革新，以二级质谱和二维核磁共振为代表的质谱技术广泛用于脂肽氨基酸顺序及其结构的鉴定[28]，例如，源后衰变-基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱、线性离子阱-轨道间串联质谱、电喷雾离子源电离三重四级杆飞行时间串联质谱和快速原子轰击质谱等新一代的质谱技术已应用到脂肽结构分析中。

在脂肽的研究发展进程中，不断涌现出新的更高效的分离纯化和结构分析方法。1994年 Peypoux等人通过二级质谱和二维核磁共振发现了SurfactinAla4；Moyne等[29]采用(NH2)2SO4沉淀、阴离子交换层析、凝胶层析、SDS-PAGE电泳、等电点电泳和质谱技术掌握到Bacillomycin D的结构信息；孙力军等[30]通过甲醇提取、离子交换层析、反向HPLC、LC-MS和ESI/MS/CID等方法分离到了Fengycin、Iturins和Surfactins；Ye等[31]通过浓HCl沉淀、甲醇萃取和MALDI-TOF-MS/MS质谱分析的方法确定了Iturin存在于Bacillussp. B47产物中。

3 脂肽的主要应用

3.1 食品工业

脂肽在食品工业中常作为乳化剂、分散剂、稳定剂等使用。Nitschke等[32]发现脂肽作用于乳化大豆油及椰子油，具有良好的乳化稳定性；Surfactins应用于大麦和肉制品中，不仅能改善含淀粉类产品的质地和保质时间，乳化部分破碎的脂肪组织，还能起到抗腐败菌、抗病原菌的能力，是潜在的天然食品防腐剂。

3.2 石油工业

脂肽在油层中能明显降低油/水的表/界面张力，使油类乳化和降粘，促进油/石分离，达到驱油、提高石油采收率的目的，也能用于漏油处理、清除原油中的沥青质和防止结蜡、清洗油罐中污泥和清洗后的原油回收等方面[33]。

Schaller等[34]发现Surfactins在极端的油藏环境下也能保持很好的表面活性，可提高沙裹油的回收率，进而提高石油采收率；Youssef等[35]发现脂肽可以开采出砂岩岩心中的捕集油，表明脂肽在微生物采油中的应用是可行的，且具有在极性条件下应用的潜力。

3.3 环境保护

3.3.1 降解多环芳烃

菲是在环境中难以被降解去除的多环芳烃。章慧[36]发现脂肽用于降解菲污染的体系时，对于菲降解菌不会产生毒害作用，相反在一定程度上可促进微生物的生长，提高菲的降解速率；在处理炼油厂废水中烷烃的过程中，将脂肽生物表面活性剂加入到活化污泥处理池中可显著提高生物降解的效率。

3.3.2 除重金属离子

脂肽可通过降低表面张力，促进重金属离子与土壤或水体分离，加强重金属离子与脂肽的络合作用。大多数脂肽对带正电的金属阳离子具有很好的螯合作用，可作为浮选捕收剂与带电胶粒相吸以除去有毒金属离子，除去如 Zn（Ⅱ）、P-B、Cu、Cd 和Cr（Ⅵ）等土壤和水体中的金属离子，解决了处理浮选收集剂毒性的问题。

3.3.3 降解有害农药

在农药污染的土壤中添加脂肽生物表面活性剂或培养表面活性剂产生菌，能显著降解有害成分。在土壤中添加生物表面活性剂降解硫丹杀虫剂，可以使降解率提高30%～45%[37]。

3.4 日化领域

脂肽具有良好的乳化和抗菌性能，对人体的生理适应性较强，在化妆品中常用作分散剂、柔软剂和增溶剂，对人体无累积毒害作用。在抗皱类化妆品中，用作乳化剂，能起到保湿的作用[38]；应用于清洗类化妆品中可起到清洗、起泡和杀菌的作用，在使产品具有良好的起泡性和洗净能力的同时，对眼睛和皮肤无刺激反应；还可以改善产品的形态和对温度的适应性[39]。

3.5 纺织工业

脂肽性能优良而且环保无毒，作为皂洗剂用于纺织加工中比皂片能更好地去除纺织品浮色[40]；作为匀染剂有助于完善纺织品染色工艺的效果；作为柔软剂可有效改善羊毛产品的柔软性；另外，脂肽在纺织加工中还可起到分散、抗静电、渗透、洗净和润湿等功能，以取代化学合成表面活性剂在纺织工业的应用。

4 脂肽目前研究重点

尽管能产生脂肽的微生物资源非常丰富，但是真正达到生产水平的并不多，主要有枯草芽胞杆菌生产的Surfactin、Iturin和Fengycin[41]；玫瑰孢链霉菌生产的Daptomycin；地衣芽胞杆菌生产的Lichenyishin；短小芽胞杆菌生产Pumilacidin、Esperin[42]。

脂肽通常通过微生物在水混溶或不混溶底物上发酵来产生，产量低一直是其瓶颈，营养底物、接种量、pH值、温度和曝气等条件均可影响脂肽的生产。因此，脂肽产量的提高可以通过优化发酵条件和选育过量生产的微生物突变体来实现。另外，菌种本身的生产能力也是不容忽视的问题，有些菌株产脂肽的水平对环境变化过于敏感，使其生产和应用受到了极大限制。

4.1 使用低成本原料

在大多脂肽数生产中，原材料成本约占生产总成本的30%～40%[43]。利用农业副产品等低成本的原材料作为底物来生产脂肽，可以显著降低生产成本[44]。据文献报道，木薯废水、植物来源的油、石油废物、淀粉物质、乳酸乳清和酿酒废物等各种廉价原料均可以作为底物来生产脂肽[45]。

Makkar等[46]发现向日葵油饼能显著提高伊枯草素A的生产量。Seghal等[47]使用工农业固体废料或残渣来优化海洋放线菌金黄色短杆菌MSA13的生物表面活性剂的生产，使产量增加到原始条件的3倍，而且还产生了新的脂肽。

4.2 使用突变体和重组菌株

突变体是实现提高脂肽产量的重要手段。闫冬等[48]通过亚硝基胍诱变多粘类芽胞杆菌，使其产生的抗菌脂肽是原来的1.71倍。李光等[49]采用利用常压室温等离子体对枯草芽胞杆菌E7进行快速诱变，获得的突变菌株SF90-5所产生的Surfactin的产量是原来的5倍。

目前，高通量筛选技术已经应用于脂肽高产突变株的筛选，主要是利用氯化十六烷基吡啶-溴百里酚蓝(CPC-BTB)显色原理来检测脂肽的含量[50]，利用96孔板来替代传统的摇瓶筛选，提高了筛选效率。除了利用突变体提高产量外，基因重组技术已经在获得高产脂肽菌株方面取得了一定的效果。 Leclere等[51]利用来源于金黄色葡萄球菌质粒pUB110的复制基因repU的组成型启动子替代枯草芽胞杆菌ATCC 6633操纵子的天然启动子获得了重组菌株BBG100，使抗霉枯草菌素的产量比野生型提高了15倍，其产量提其产量提高的效率远远高于常规诱变。

4.3 脂肽的提取和纯化

脂肽需要从发酵液中分离纯化后方能付诸应用，但生产过程中产生的泡沫使分离纯化非常困难。Jauregi等[52]用壳聚糖固定芽胞杆菌属细胞，解决了有氧生产脂肽过程中的发泡问题。固定细胞可以在搅拌式发酵罐中重复使用，既可维持高脂肽产量，又能使脂肽的回收变得简单易行，从而达到部分纯化和浓缩脂肽的目的，分流出的泡沫体对许多石油样品显示出高表面活性，该方法相对易操作、成本低、并且对环境友好。

混合盐析、酸沉淀和超滤等多种下游处理技术联用是目前脂肽分离的主要手段，但是多种技术联用会导致产品回收率降低[53]，因此改良下游的分离提纯工艺依然是脂肽生产亟待解决的问题。硅胶柱层析虽然可以有效的分离某些脂肽，但是分离过程中用到的某些有机溶剂会明显降低脂肽的活性，因此分离过程中应尽量减少有机溶剂的使用。Khondee等[54]通过两步超滤法提取产物中的脂肽，根据脂肽聚集形成胶束的大小来选择最合适的MWCO膜，不但程序简单，回收率高，而且得到的表面活性素纯度可达94 %，抗霉枯草菌素纯度可达到90.02%。

5 结语

虽然脂肽类生物表面活性剂具有优秀的表面活性和抗菌、抗病毒、抗肿瘤等诸多生物活性，在石油、食品、医药、日化等领域有望获得广泛的应用，但由于居高不下的成本限制，大部分脂肽仍处于实验室研究阶段，离工业化生产和商业化应用尚有很大的距离，尤其是我国，对脂肽类的研究起步较晚，有关研究尚不成熟。但我们相信，随着生物技术（工程）、基因工程以及有关分析测试手段的不断进步和发展，对脂肽类研究将会不断深入，人们将更深入的认识脂肽的生产调控机制，分子结构，进而通过构建基因工程菌和优化培养条件、改善分离工艺、拓宽原材料范围，不断提高脂肽的产量，降低其成本，早日实现工业化生产和商业化应用。