黄原胶寡糖的抑菌活性研究

王子朝，宁 涛，张慧茹，詹晓北，吴剑荣，高敏杰

1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001 2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122

抗生素作为预防和控制疾病、提高养殖效益的有效手段，在禽畜饲养中应用十分普遍[1]。但抗生素滥用不仅促使病原菌产生了耐药性[2]，还导致动物来源食品中抗生素残留过量，影响产品质量和食品安全；同时，食品中残留的抗生素通过食物链最终进入人体，对人类健康造成极大危害[3-4]。因此，寻找防病、抗病，提高机体免疫力和促生长的绿色抗生素替代品迫在眉睫[5-6]。黄原胶是被美国食品和药品管理局批准的一种无限量食品添加剂，其侧链和主链通过氢键形成多重螺旋高级结构，一些活性基团被包裹在结构内部，限制了黄原胶的生物活性发挥[7]，使得改性黄原胶及其寡糖研究引起了广泛关注。

目前，降解黄原胶有物理、化学和生物等多种方法。李彦杰[8]采用辐照降解黄原胶，所得黄原胶寡糖具有良好的抗氧化性和抑菌活性。Xiong等[9]在碱性条件下降解黄原胶，得到的3种低分子量黄原胶寡糖均表现出良好的抗氧化活性。Wu等[10]采用双氧水对黄原胶进行降解，所得黄原胶寡糖具有良好的清除羟基自由基活性。何晓燕等[11]采用Cellulomonassp.XT11对黄原胶进行降解，所得黄原胶寡糖不仅具有清除羟基自由基能力，还能激活植物防卫系统抵御病原菌侵染。物理和化学法降解黄原胶，不仅对生产设备要求高，还容易造成环境污染，而微生物法则具有反应条件温和、易控制、污染小等优点[8-9]。因此，作者采用球毛壳菌CGMCC 6882对黄原胶进行降解，并对其降解所得寡糖进行结构解析和抑菌活性探索。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

球毛壳菌CGMCC 6882是从植物绞股蓝中分离得到并保存于中国微生物菌种保藏中心的菌种，专利号：ZL 201310002710.3。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号分别为EscherichiacoliCICC 10899和StaphylococcusaureusCICC 10001。

1.2 试验试剂与仪器

马铃薯：市售；黄原胶：索莱宝生物科技有限公司；溴化钾、硫酸铵、葡萄糖、硫酸锌、氯化钙等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。摇床：上海国强生化有限公司；离心机：德国Sigma公司；全自动馏分收集器：上海青浦沪西仪器厂；冷冻干燥机：美国Labconco公司；高效体积排阻色谱：美国Waters公司；WQF-510红外光谱仪：北京北分瑞利分析仪器公司；磁力搅拌器：常州市天竟实验仪器厂；生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.3 主要培养基

PDA培养基：马铃薯100 g(切碎煮沸30 min,过滤取滤液)、葡萄糖10 g、琼脂10 g、蒸馏水500 mL。

黄原胶发酵培养基：硫酸铵1.0 g、七水合硫酸镁1.0 g、磷酸二氢钾1.5 g、磷酸氢二钾1.5 g、氯化钠0.5 g、氯化钙0.3 g、硫酸铁0.01 g、硫酸锰0.01 g、硫酸锌0.01 g、黄原胶10.0 g、蒸馏水1 000 mL。

营养琼脂培养基：蛋白胨5.0 g、牛肉膏1.5 g、氯化钠2.5 g、营养琼脂10.0 g、蒸馏水500 mL。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨15.0 g、氯化钠5.0 g，加入蒸馏水1 000 mL，调节pH值为7.0±0.2。

1.4 黄原胶寡糖的制备

将球毛壳菌CGMCC 6882接种至以黄原胶为唯一碳源的发酵培养基，150 r/min、28 ℃发酵培养7 d。发酵结束后，离心发酵液除去菌体及不溶性杂质后收集上清液，上清液中加入3倍体积的Sevag试剂进行脱蛋白，反复4～5次后加入活性炭进行脱色并离心收集上清液。上清液中加入无水乙醇至体积分数为80%，除去未降解完的大分子量黄原胶，继续加入无水乙醇至体积分数为90%并放入4 ℃冰箱过夜，析出黄原胶寡糖。将烧杯从冰箱取出，去除上清液并加入适量去离子水复溶黄原胶寡糖，采用Sepharose CL-6B(2.5 cm×60 cm)进行柱层析分离并配以馏分收集器收集黄原胶寡糖溶液组分，将收集的组分进行冻干处理以制备黄原胶寡糖。

1.5 单糖组成测定

参考Wang等[12]的方法，采用CarboPac PA20(150 mm×3 mm)色谱柱进行单糖组成检测，用20 mmol/L NaOH溶液等度洗脱。进样量25 μL，流速0.4 mL/min，柱温30 ℃，检测15 min。

1.6 分子质量测定

采用高效体积排阻色谱测定分子质量，Ultrahydrogel TMLinear 300 mm×7.8 mm id二级串联柱，柱温45 ℃；流动相0.1 mol/L NaNO3，流速0.9 mL/min。用分子质量分别为270、975、3 680、13 535 kDa的葡聚糖标品绘制分子质量校正曲线，根据样品保留时间和校正曲线计算黄原胶寡糖分子质量。

1.7 红外光谱检测

分别称取1.0 mg商品级黄原胶与黄原胶寡糖样品，与200 mg溴化钾混匀后充分研磨并压片，采用WQF-510红外光谱仪对样品进行扫描，波数范围400～4 000 cm-1，并用OMNIC-8.2软件处理红外数据。

1.8 指示菌的活化

将大肠杆菌在营养琼脂平板上划线活化，挑取活化后长势良好的指示菌于无菌生理盐水中，采用平板计数法调整菌悬液浓度约为3×106CFU/mL作为菌悬液A；用无菌肉汤调整菌悬液浓度为106CFU/mL作为菌悬液B。

1.9 黄原胶寡糖溶液制备

称取1.0 g黄原胶寡糖样品溶于100 mL蒸馏水，充分搅拌溶解，配制成10 mg/mL黄原胶寡糖溶液。

1.10 抑菌圈测定

用微量移液器吸取100 μL指示菌菌悬液A涂布于营养琼脂培养基，取直径为7 mm的打孔器在涂有指示菌的培养基上打孔，吸取100 μL黄原胶寡糖溶液滴入孔中，每组试验设3个重复，以滴加蒸馏水作空白对照，置于37 ℃培养箱中培养48 h。用游标卡尺测量抑菌圈直径，取其平均值。

1.11 最小抑菌浓度(MIC)测定

以10 mg/mL黄原胶寡糖溶液作为原液，用孔径为0.22 μm滤膜过滤，采用二倍稀释法测定。用牛肉膏蛋白胨液体培养基将原液分别稀释2、4、8、16、32、64、128和256倍，取不同稀释倍数的培养液200 μL加入96孔酶标板中，每孔加入10 μL指示菌菌悬液B；同时设阴性对照(仅含牛肉膏蛋白胨液体培养基)。于37 ℃培养箱中培养48 h，肉眼观察，孔中菌液澄清判定为有抑菌效果，菌液浑浊则判定为有菌生长[13]。在澄清与浑浊的分界处，此稀释浓度即为MIC，对每个浓度做3组平行试验。

1.12 最小杀菌浓度(MBC)测定

以最小抑菌浓度为基础，用牛肉膏蛋白胨液体培养基将寡糖原液分别稀释2、4、8、16、32和64倍，分别编号1—6。接种大肠杆菌后，将培养皿置于恒温培养箱中37 ℃培养48 h，平皿中无细菌生长的培养皿所对应浓度为最小杀菌浓度。

1.13 金黄色葡萄球菌抑菌活性检测

金黄色葡萄球菌抑菌活性检测方法与大肠杆菌相同。

2 结果与分析

2.1 黄原胶寡糖的制备

相较于辐照、强酸碱、强氧化剂等对设备要求高和容易造成环境污染的缺点，微生物法降解黄原胶具有反应条件温和、易控制和污染小等优点[8-9]。球毛壳菌CGMCC 6882在以黄原胶为唯一碳源的液体培养基中长势良好(图1)，说明球毛壳菌CGMCC 6882可以降解和利用黄原胶。发酵结束后，将发酵液经过滤除菌、梯度醇沉、脱蛋白、除色素、柱层析分离和冷冻冻干处理，得到黄原胶寡糖样品。

图1 球毛壳菌CGMCC 6882在黄原胶培养基中的生长情况

2.2 黄原胶寡糖的单糖组成与分子质量检测

由图2可知，商品级黄原胶和黄原胶寡糖所含单糖种类相同，均为葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，初步说明黄原胶经球毛壳菌CGMCC 6882降解所得产物为黄原胶寡糖。同时，商品级黄原胶分子质量约为3×106Da，而黄原胶寡糖分子质量约为4.070×104Da。Song等[14]发现糖苷键类型和岩藻糖含量能够影响Pleurotusgeesteranus多糖的抗氧化性，Zhang等[15]发现Pleurotustuber-regium多糖分子质量影响其抗肿瘤活性。单糖组成及比例和分子质量大小会影响多糖及寡糖的生物活性，这可能使黄原胶寡糖具有不同生物活性。

图2 商品级黄原胶和黄原胶寡糖的单糖组成

2.3 红外光谱分析

图3 商品级黄原胶和黄原胶寡糖的红外光谱

2.4 抑菌圈直径测定

参照Khan[17]抗生素抑菌效果的判定标准：抑菌圈直径大于15 mm为高度敏感，10～15 mm为中度敏感，7～9 mm为低度敏感，无抑菌圈则为不敏感。由表1可知，黄原胶寡糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均直径分别为18.42 mm和33.51 mm，说明本试验所制备黄原胶寡糖对金黄色葡萄球菌抑菌效果更好。Jiang等[18]从绿豆皮中提取的两种水溶性多糖MBP-1和MBP-2对大肠杆菌无抑制作用，对金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径分别为(8.8±0.3)mm和(9.3±0.3)mm。Mourad等[19]从乌贼皮和肌肉中所提取硫酸化多糖对大肠杆菌的最大抑菌圈直径为(24.2±1.1)mm，但其对金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径为(18.0±0.0)mm。

表1 抑菌圈直径

2.5 MIC和MBC测定

最小抑菌浓度与最小杀菌浓度是判断抑菌物质抑菌活性大小的重要指标[20]。由表2可知，黄原胶寡糖对大肠杆菌的MIC和MBC分别为2.50 mg/mL和10.00 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为0.63 mg/mL和1.25 mg/mL。钱方[21]和李彦杰[8]所制备黄原胶寡糖对野油菜黄单胞菌具有很好的抑菌活性，黄成栋[22]所制备黄原胶寡糖对玉米大斑病菌、番茄早疫病菌、瓜类枯萎病菌和辣椒疫霉4种真菌具有较强抑制作用，但对大肠杆菌、白菜软腐病菌、烟草青枯病菌、柑橘溃疡、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌却没有任何抑制效果。多糖的抑菌活性可能与其结构中单糖组成及比例、分子质量大小、羟基与糖醛酸数量和比例、糖苷键种类与数量、硫酸化与否、空间结构和水溶液黏度等相关[23]。

表2 黄原胶寡糖最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定结果

3 结论

与物理法和化学法相比，微生物法制备黄原胶寡糖具有反应条件温和、易控制、污染小等优点。本试验采用球毛壳菌CGMCC 6882降解黄原胶，所得黄原胶寡糖分子质量为4.070×104Da，是商品级黄原胶(3×106Da)的百分之一左右。黄原胶寡糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出明显的抑制作用，对大肠杆菌的MIC和MBC分别为2.50 mg/mL和10.00 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为0.63 mg/mL和1.25 mg/mL。