泡吴茱萸中吴茱萸碱?吴茱萸次碱和柠檬苦素含量测定方法研究

周劲松　陈俊禧　罗文英　马恩耀　孔箭　侯皓然

摘要 [目的]建立HPLC法同时测定泡吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素含量的方法。[方法]采用Agilent 5 TC-C18（2）（250 nm×4.6 nm，5 μm） 色谱柱，流动相为乙腈-水溶液（53∶47，V/V），等度洗脱，检测波长为215 nm，流动相的流速为1  mL/min，色谱柱的柱温为25 ℃。[结果]在该检测方法下吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素分离度良好，3种成分在对应范围内有良好的线性关系;吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素的平均回收率分别为98.0%、97.8%、97.3%（n=6）。[结论]该方法简便、准确、分离度高、重复性良好，适用于泡吴茱萸的质量控制。

关键词 泡吴茱萸;吴茱萸碱;吴茱萸次碱;柠檬苦素;含量;测定方法;质量控制

中图分类号 R 284文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）16-0188-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.053

Determination of Evodiamine，Rutaecarpin and Limonin in Evodia rutaecarpa

ZHOU Jing-song1，CHEN Jun-xi2，LUO Wen-ying1 et al （1.Guangzhou Caizhilin Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510360;2.Chinese Medicine Pieces Factory，Guangzhou Medicine Material Corporation，Guangzhou，Guangdong 510360）

Abstract [Objective]To establish the methods of determining the contents of evodiamine，rutacarpine and limonin in Evodia rutaecarpa by HPLC simultaneously.[Method]Agilent 5 TC-C18（2） （250 nm×4.6 nm，5 μm） chromatographic column was adopted，the mobile phase was acetonitrile-aqueous solution （53∶47，V/V），the same degree of elution，the detection wavelength was 215 nm，the flow rate of mobile phase was 1 mL/min，and the column temperature of chromatographic column was 25 ℃.[Result]The separation of evodiamine，rutaecarpin and limonin was good.The three components were linear in the corresponding range;the average recovery of evodiamine，rutaecarpin and limonin was 98.0%，97.8%，97.3% （n=6），respectively.[Conclusion]The method is simple，accurate and reproducible，and is suitable for the quality control of Evodia rutaecarpa.

Key words Evodia rutaecarpa;Evodiamine;Rutaecarpin;Limonin;Content;Measuring method;Quality control

基金項目 国家重点研发计划中医药现代化研究重点专项（2018YFC1707100）;国家科技重大专项课题（2018ZX09721004-001）;2018年工业转型升级（部门预算）项目（0714-EMTC-02-00576）。

作者简介 周劲松（1975—），男，江苏常州人，工程师，博士，从事中药资源及质量研究。*通信作者，主管药师，从事中药饮片质量控制研究。

收稿日期 2020-01-21;修回日期 2020-02-24

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth]、疏毛吴茱萸[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.bodinieri （Dode） Huang]或石虎[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth var.officinalis （Dode） Huang]的干燥近成熟果实[1]。吴茱萸具有降逆止呕、散寒止痛、助阳止泻的功效。药用的吴茱萸主要以栽培为主，其产区主要分布在贵州、重庆、湖南、江西、广西、浙江等地。现代研究表明，吴茱萸中含有多种化学成分，主要为生物碱类、柠檬苦素类、挥发油类、木脂素、黄酮、多糖等[2]，其中生物碱类为其主要有效成分，具有镇痛、抗炎等药理作用[3-4]。

对于吴茱萸炮制品自汉代起就有记载，同时吴茱萸的炮制方法全国各地方也收载了很多[5]。《本草纲目》中有提到：“茱萸性热，能散能温，苦热能燥能坚，故所治之症，皆取其散寒温中，燥湿解郁之功而已。”属于临床常用的中药，其主要有效成分集中在柠檬苦素、吴茱萸次碱和吴茱萸碱等[6]，但由于吴茱萸辛苦，性热，有小毒，不利于疗效，故历代中医对其进行了辅料和不同的炮制方法研究，使其降低毒副作用与增加疗效[5]。热水（开水）泡制亦为吴茱萸的传统炮制方法之一。沸水泡制能够有效降低吴茱萸的毒性，因此，采用沸水泡制方法制备而成的饮片品种“泡吴茱萸”仍在临床使用。但现行的检测方法当中没有泡吴茱萸的含量测定方法，而以2015版《中华人民共和国药典》中规定的吴茱萸含量测定方法进行检测，存在分离度低的现象，不利于泡吴茱萸的质量控制。该研究旨在建立泡吴茱萸的专属含量测定方法，为泡吴茱萸的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器。

JA3003电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）;Secura 225D-1CN电子天平（德国赛多利斯集团）;GZX-9070 MBE电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;DMF-4B手提式高速中药粉碎机（温岭市铭大药材机械设备有限公司）;UltiMate3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）;KQ-300DA数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1.1.2 材料。

吴茱萸碱对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号：110802-201710，含量以99.6%计）;吴茱萸次碱对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号：110801-201608，含量以99.7%计）;柠檬苦素对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号：110800-201707，含量以97.9%计）;甲醇、乙醇（天津市大茂化学试剂厂）;乙腈（上海星可高纯度溶剂有限公司）。

泡吴茱萸为自制，共有10批。所用吴茱萸药材由广州市药材公司中药饮片厂提供，经广州中医药大学高明副教授鉴定为芸香科植物吴茱萸[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.]、石虎[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.officinalis （Dode） Huang] 或疏毛吴茱萸[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.bodinieri （Dode） Huang] 的干燥近成熟果实。

饮片炮制方法：①Ⅰ法。参考《广东省中药炮制规范（1984版）》方法，取吴茱萸，洗净，置沸水中略泡，捞出，晒干即得。②Ⅱ法。参考《江西省中药饮片炮制规范（2008年版）》方法，取吴茱萸，用开水泡约1 h至顶端开口，再置锅内炒热，洒入盐水至发香气，焙干。每100 kg吴茱萸，用食盐3 kg。该试验所用样品的信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制备。

1.2.1.1 对照品溶液的制备。

分别精密称取吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、柠檬苦素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含吴茱萸碱80 μg、吴茱萸次碱50 μg、柠檬苦素100 μg的混合溶液，即得。

1.2.1.2 供试品溶液的制备。取本品粉末（过3号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入25 mL 70%乙醇，称定重量，静置浸泡45 min，超声处理30 min（超声功率为300 W，超声频率为32 kHz），冷却后，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.2 色谱条件。色谱柱：Agilent 5 TC-C18（2）（250 nm×4.6 nm，5 μm）;流动相：乙腈-水（53∶47，V/V）;柱温：25 ℃;检测波长：215 nm;进样量：10 μL;流速：1  mL/min。

1.2.3 线性关系考察。

配制吴茱萸碱、吴茱萸次碱及柠檬苦素的对照品溶液，吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素的浓度分别为8.12、5.33、10.12 μg/mL。將上述对照品溶液分别进样2、5、10、15、25 μL进行测定，记录峰面积。以这3个成分峰面积为横坐标、含量为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4 精密度试验。取对照品溶液，连续进样6次，测定其峰面积并计算RSD。

1.2.5 重复性试验。

精密称取6份批号5的泡吴茱萸粉末，使用“1.2.2”色谱条件进行检测，测定其峰面积并计算RSD。

1.2.6 稳定性试验。精密称取批号5的泡吴茱萸粉末，按“1.2.1.2”方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8 h按“1.2.2”色谱条件进样，测定其峰面积并计算RSD。

1.2.7 加样回收率试验。

取批号5的泡吴茱萸粉末6份适量，精密称量，分别精密加入吴茱萸次碱、吴茱萸碱、柠檬苦素对照品溶液适量，按“1.2.1.2”方法制备成供试品溶液，测定吴茱萸次碱、吴茱萸碱、柠檬苦素的含量，计算加样回收率：回收率=（加标后样品中检测含量-样品中的检测含量）/加入量×100%。

1.2.8 泡吴茱萸饮片含量测定。取表1中的10批泡吴茱萸样品，按“1.2.1.2”方法制备供试品溶液，并按“1.2.2”色谱条件对每批样品平行测定3次。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

以吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素峰面积为横坐标，含量为纵坐标，绘制标准曲线，得出吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素的回归方程分别为Y=0.013 7X+0.001 5（R2=0.999 4）、Y=0.003 3X+0.000 5（R2=0.999 5）、Y=0.355 9X+0.001 4（R2=0.999 1），表明3种成分在对应范围内有良好的线性关系。

2.2 精密度试验 按照“1.2.4”方法操作，计算得出吴茱萸次碱、吴茱萸碱、柠檬苦素的RSD分别为1.22%、1.71%、0.25%，表明仪器精密度符合要求。

2.3 重复性试验 按照“1.2.5”方法操作，计算得出吴茱萸次碱、吴茱萸碱、柠檬苦素的RSD分别为0.37%、0.64%、0.22%，表明该方法重复性良好。

2.4 稳定性试验 按照“1.2.6”方法操作，计算得出吴茱萸次碱、吴茱萸碱、柠檬苦素的RSD分别为0.71%、0.82%、0.18%，表明样品在8 h内保持稳定。

2.5 加样回收率试验 按照“1.2.7”方法操作，结果发现（表2），吴茱萸碱的平均回收率为98.0%，RSD=0.55%;吴茱萸次碱的平均回收率为97.8%，RSD=0.98%;柠檬苦素的平均回收率为97.3%，RSD=1.05%，表明该方法准确度高。

2.6 泡吴茱萸饮片含量测定

从表3～4可以看出，泡吴茱萸样品中柠檬苦素含量为0.42%～0.70%，平均值0.54%;吴茱萸碱含量为0.36%～1.32%，平均值0.73%;吴茱萸次碱含量为0.19%～0.60%，平均值0.36%。对照品和样品色谱图见图1。

3 结论与讨论

从吸收波长选择方面来看，采用紫外-可见分光光度计在200 ～ 320 nm 分析对照品和供试品溶液，发现在205 nm 处柠檬苦素有最大吸收，而吴茱萸碱、吴茱萸次碱在 225 nm 处有最大吸收，故该试验最终确定采用 215 nm 作为3个成分的最佳吸收波长进行检测。

从流动相选择方面来看，2015 年版《中华人民共和国药典》以[乙腈 - 四氢呋喃（25-15）]-0.02%磷酸溶液（35-65）为流动相，但是分析时间长，而且不稳定，不同的含量测定试验之间差异较大。部分学者采用乙腈 - 水为流动相主体[7]，变化比例或者添加磷酸缓冲液组成流动相测定柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱[8-10]。该研究采用乙腈 - 水（53∶47，V/V）为流动相，柠檬苦素的出峰时间由10.98 min 缩减到5.82 min，吴茱萸碱的出峰时间由22.74 min 缩减到7.89 min，吴茱萸次碱出峰时间由25.76 min 缩减到9.19 min，其出峰时间都在15 min 以内，降低了检测时间，提高了检测效率，故选择乙腈 - 水（53∶47）为流动相。

综上所述，该研究建立的HPLC泡吴茱萸含量检测方

法，操作简便，试验结果稳定可靠，为吴茱萸炮制品质量控制提供了依据。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京： 中国医药科技出版社，2015：100-105.

[2] 楼璐璐，徐姗姗，方淡思.吴茱萸化学成分与质量控制研究进展[J].中华中医药学刊，2017，35（8）：2154-2157.

[3] 龚慕辛，王智民，张启伟，等.吴茱萸有效成分的药理研究进展[J].中药新药与临床药理，2009，20（2）：183-187.

[4] 张婧怡，林淑娴，李利生，等.吴茱萸次碱对腹主动脉缩窄大鼠左室肥厚的抑制作用[J].医药导报，2018，37（2）：152-156.

[5] 肖洋，段金芳，刘影，等.吴茱萸炮制方法和功能主治历史沿革[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（3）：223-228.

[6] 战光绪，吴大正，胡之璧.吴茱萸有效成分的药理研究进展[J].上海中医药杂志，2006（2）：62-64.

[7] 刘湘丹，蔡嘉洛，邹君华，等.吴茱萸及其炮制品中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素成分含量对比分析[J].中医药导报，2016，22（3）：39-41.

[8] 毛玲，张秀秀，韦国兵.HPLC 法测定吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量[J].井冈山大学学报（自然科学版），2016，37（2）：97-101.

[9] 姬海南，杜新亮，孟晶，等.高效液相色譜法同时测定吴茱萸汤中 5 种活性成分的含量[J].中南药学，2017，15（1）：92-95.

[10] 于鹰，王均宁，张成博.基于古代文献的吴茱萸临床应用探要[J].西部中医药，2015， 28（9）： 37-39.