水杨酸?甲基茉莉酸与伤诱导对烟草sm-Nvas同源基因表达调控的初步研究

邵敏敏　何福收　陈同　王春台　谭艳平

摘要 [目的]研究Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata这2种烟草中sm-Nvas同源基因分别在经水杨酸（SA） 、甲基茉莉酸（MeJA）及伤诱导后的表达情况。[方法]采用Trizol法提取经水杨酸、甲基茉莉酸及伤处理后的2种烟草叶片的总RNA，转录成cDNA，利用实时荧光定量PCR检测sm-Nvas同源基因的表达量并进行数据分析。[结果]通过对烟草叶片中sm-Nvas同源基因的表达量分析，结果表明水杨酸、甲基茉莉酸及伤处理能对sm-Nvas同源基因的表达起调控作用。[结论]用SA、MJA和伤处理Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata烟草，发现sm-Nvas的表达量均有所增加。在处理8 h后其表达量发生了明显的变化，在12～16 h其表达量的增加达到峰值。这对研究烟草的sm-Nvas及其同源基因的功能奠定重要的基础。

关键词 甲基茉莉;水杨酸;伤害处理;实时荧光定量PCR;sm-Nvas;同源基因;烟草

中图分类号 Q 786文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）16-0105-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.028

Effects of Salicylic Acid，Methyl Jasmonate and Wound Induction on the Expression of sm-Nvas Homologous Genes in Tobacco

SHAO Min-min，HE Fu-shou，CHEN Tong et al （School of Life Sciences，South-Central University for Nationalities，Hubei Provincial Key Laboratory of Characteristic Plant Germplasm Protection and Utilization in Wuling Mountains，State Key Laboratory of Biotechnology，Wuhan，Hubei 430074）

Abstract [Objective]To study the expression of sm-Nvas homologous genes in two tobaccos，Nicotiana sylvestris and Nicotiana attenuata，after salicylic acid （SA），methyl jasmonate （MeJA） and wounding induction，respectively.[Method]Total RNA was extracted from the  two tobacco leaves treated with SA，MeJA and wounding using Trizol method，and then reverse transcribed into cDNA.The expression of sm-Nvas homologous gene was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and the data were analyzed.[Result]Based on analysis of the expression level of sm-Nvas homologous genes in tobacco leaves，it showed that salicylic acid，methyl jasmonic acid and wound treatment could regulate the expression of sm-Nvas homologous genes.[Conclusion]After SA，MJA and wounding treatment of Nicotiana sylvestris and Nicotiana attenuata tobacco，the expression of sm-Nvas homologous gene increased.After 8 hours of treatment，all the expression levels changed significantly，and reached the peak at about 12-16 hours.This will lay an important foundation for studying the function of sm-Nvas and its homologous genes in tobacco.

Key words Methyl jasmonic acid;Salicylic acid;Injury treatment;Real-time PCR;sm-Nvas;Homologous genes;Tobacco

基金項目 湖北省自然科学基金项目（2018CFB481）;中南民族大学研究生学术创新基金项目（2019sycxjj237）。

作者简介 邵敏敏（1990—），女，江苏南通人，硕士研究生，从事植物遗传学研究。*通信作者，副教授，硕士生导师，博士，从事烟草水稻功能基因的相关研究。

收稿日期 2020-02-24;修回日期 2020-03-26

烟草维管束发育相关基因sm-Nvas是一个受水杨酸（SA） 和甲基茉莉酸（MeJA）特异性诱导表达的基因。利用5′端缺失分析法把sm-Nvas基因启动子ATG+1～-463区域序列截成片段插入到含有GFP标签的双元表达载体中，转入W38型烟草植株。转基因烟草中的绿色荧光主要集中在维管束组织中表达，说明该基因特异表达于维管束中[1]。已经有试验表明把该基因导入到植物中，将导致转基因植株矮化、叶脉增多、茎和叶脉增粗等一系列表型变化[2-3]。sm-Nvas基因由1 392个碱基组成，编码463个氨基酸。经抗病性鉴定发现，该基因具有增强水稻对稻瘟病以及油菜对菌核病抗性的特征[4]。sm-Nvas基因属于糖基转移酶家族成员，糖基转移酶的功能涉及细胞中某些多糖的产生和生物大分子的代谢[5-6]，同时还能参与植物的抗性反应[7]。在植物激素作用和植物抗性反应方面，糖基转移酶又与信号的感受和传递有关[8]。

水杨酸是一种植物内源激素[9]，它在黄瓜、烟草和拟南芥中的升高伴随着抗性的增加[10]。有研究表明，在荞属植物体中SA和MeJA相互协同可以抵御病原体的侵害[11]。在烟草和拟南芥体内导入NahG基因会让SA失活最终导致植物抵抗力明显下降[12]。

一般而言，同源基因的功能具有相似性。在前期工作中，从Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata烟草中克隆了sm-Nvas同源基因。经序列比对发现，它们的开放阅读框长度相同，都为1 392个碱基，但碱基序列不完全相同，Nicotiana sylvestris烟草与它的同源性为94%，而Nicotiana attenuata烟草的同源性为95%。编码的463个氨基酸Nicotiana sylvestris有427个氨基酸相同，92%的同源性，Nicotiana attenuata有435个氨基酸相同，94%的同源性。为了研究这2个同源基因是否同样受激素和伤诱导，该研究利用外源激素和伤害处理烟草叶片，分析同源基因表达情况，以期为后期进一步研究sm-Nvas同源基因的特征和功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata烟草。

1.1.2 试剂。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試剂盒（TaKaRa公司）;SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO公司）;Trizol试剂（Invitrogen公司）;三氯甲烷（国药集团）;异丙醇（国药集团）;无水乙醇（国药集团）;DEPC（Bio-shop公司）;1 mmol/L SA溶液;2 mmol/L SA溶液;1 mmol/L MeJA溶液;2 mmol/L MeJA溶液。

1.2 方法

1.2.1 引物设计。以烟草中跨一段内含子的ACTIN基因作为对照内参来检测分析基因表达情况。ACTIN的正向引物：5′-GCCATCAGCAACAAATACCA-3′，反向引物：5′-GCCTCATCACCAACATAAGCA-3′;sm-Nvas的正向引物：5′-CCTTGACTGGTTGGGTTGGT-3′，反向引物：5′-AACGAAGGCAAATCCCGAGG-3′。

1.2.2 烟草植株的处理。对Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata烟草植株分别用1 mmol/L SA溶液、2 mmol/L SA溶液、1 mmol/L MeJA溶液、2 mmol/L MeJA溶液以及伤害处理叶片背面，并用水溶液处理作对照，处理时间分别为8、12、16和20 h。

1.2.3 Trizol 法提取叶片的总RNA。取被处理的叶片0.1 g于1.5 mL的EP管中加液氮研磨成粉末，加入1 mL Trizol振荡均匀，冰上静置8 min，加入200 μL三氯甲烷剧烈振荡10 min 后4 ℃冷冻离心机12 000 r/min离心15 min，转移450 μL 上清液到新的1.5 mL EP管中，加300 μL异丙醇轻柔混匀，室温静置8 min，4 ℃冷冻离心机10 000 r/min离心10 min弃上清液，在沉淀中加700 μL 75%乙醇悬浮沉淀，4 ℃ 冷冻10 000 r/min离心5 min弃上清，重复洗涤1次。上清液去除干净，通风干燥3 min至沉淀变得半透明，加入20 μL DEPC处理水，溶解后于65 ℃变性15 min后迅速置于冰上冷却，再放置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 去除基因组DNA与逆转录合成cDNA。取上一步提取出来的1 μg 总RNA用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒中DNaseⅠ去除基因组DNA，后用试剂盒里的Prime Script RT Enzyme Mix I和RT Prime Mix逆转录合成cDNA。

1.2.5 cDNA的ACTIN检测。把反转录得到的cDNA用ACTIN引物进行PCR反应进行cDNA质量检测，扩增体系为15 μL，ACTIN扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环;12 ℃保存。

1.2.6 实时定量 PCR。将cDNA稀释2倍，以ACTIN基因为内参，cDNA为模板采用实时定量PCR检测烟草sm-Nvas同源基因的表达量，15 μL扩增体系为4.5 μL 水 、7.5 μL SYBR Mix、1 μL 引 物 Mix 和 2.0 μL 的cDNA。反应程序为95  ℃预变性10 s;95  ℃变性5 s，60  ℃退火10 s，40 个循环;72  ℃延伸40 s，收集荧光信号并观察熔解曲线，每个基因设置3个重复。

2 结果与分析

2.1 cDNA的检测

利用内参基因ACTIN 检测cDNA 质量可用，并且无基因组DNA污染（图1）。条带单一，大小为250 bp左右。因为cDNA的模板量浓度有一些差异，导致目的条带的明暗程度不一样，经调整cDNA模板浓度后可进行下一步的荧光定量PCR试验。

2.2 实时定量PCR的结果 该试验的烟草sm-Nvas同源基因检测成功，熔解曲线峰值单一，无非特异性扩增。以未处理过的烟草叶片作为参照，不同激素处理和伤害处理过的叶片为试验样本。用水杨酸处理Nicotiana sylvestris烟草叶片后sm-Nvas同源基因的表达情况如图2，结果显示，1 mmol/L水杨酸处理Nicotiana sylvestris烟草8 h后sm-Nvas同源基因的表达量开始升高，12 h持续升高，到了16 h达到最高峰值然后开始下降，到20 h时已经降到了比较低的水平，但是仍然高于对照组。与1 mmol/L SA处理的结果相似，2 mmol/L水杨酸处理8 h后sm-Nvas同源基因开始升高，到12 h时增加速度比较缓慢，16 h后sm-Nvas同源基因表达量迅速升高到了最大峰值然后在20 h后下降。

用MeJA处理Nicotiana sylvestris烟草叶片后sm-Nvas同源基因的表达量情况如图3，结果显示，1 mmol/L的MeJA处理Nicotiana sylvestris后8 h时sm-Nvas同源基因的表达量开始升高，12 h表达量稳定增加直到16 h时表达量达到最高峰值然后开始下降，20 h时迅速下降到比8 h还要低。与1 mmol/L MeJA处理情况比较相似，2 mmol/L MeJA处理的叶片中sm-Nvas同源基因的增长和下降趋势一致，只是整体的增加量并没有1 mmol/L MeJA处理的增长量大。

用SA处理Nicotiana attenuata烟草叶片后sm-Nvas同源基因的表达情况如图4，结果显示，1 mmol/L SA处理Nicotiana attenuata叶片8 h后sm-Nvas同源基因的表达量有一些上升但并不明显，到12 h后sm-Nvas同源基因相较于8 h已经有了比较高的表达量，直到16 h时无明显增加，而到20 h同源基因表达量已经下降，但其表达量依旧高于对照组。与1 mmol/L SA处理的情况略有不同，2 mmol/L SA处理8 h后sm-Nvas同源基因表达量升高，12 h迅速达到最高峰值，在16 h后迅速下降。

用MeJA处理Nicotiana attenuata烟草叶片后sm-Nvas同源基因的表达量情况如图5，结果显示，1 mmol/L MeJA处理8 h后sm-Nvas同源基因的表达量逐步升高，16 h达到最高峰值，在20 h后迅速下降，稍高于对照组。与1 mmol/L MeJA处理结果稍微不同的是，2 mmol/L MeJA处理8 h后sm-Nvas同源基因的表达量升高，到12 h增加的幅度很缓慢，16 h 明显增加，但20 h又迅速下降。

损伤处理Nicotiana sylvestris烟草叶片后sm-Nvas同源基因的表达量如图6，结果显示，损伤处理8 h后sm-Nvas同源基因升高到12 h表达量略微下降，到了16 h表达量降低到比对照组还要低的程度后又在20 h时缓慢回升，但是依旧低于对照组。

损伤处理Nicotiana attenuata烟草叶片后sm-Nvas同源基因的表达量情况如图7，结果显示，损伤处理后8 h表达量升高，到12 h表达量持续增加到达最大峰值，在16 h后降低，直到20 h后表达量低于对照组。

3 结论与讨论

该试验研究了水杨酸、甲基茉莉酸以及损伤处理烟草Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata叶片后，其sm-Nvas同源基因表达量的变化。直系同源基因通常是由同一个祖先进化而来的，一般而言是一些功能比较重要的，例如一些酶和调控重要生命活动的蛋白类，通常这类蛋白的进化程度小，进化速度也很慢。该类基因一般在序列上保守性很高，功能相同或相近，调控途径也相似[13]。研究结果显示不同浓度的SA和MeJA对sm-Nvas同源基因表达量的变化略有不同，但都表现出相似的特征，说明同源基因也具有被SA、MeJA诱导的特征，这一特性与sm-Nvas相似。在烟草Nicotiana sylvestris中，1 mmol/L SA处理8～12 h后sm-Nvas同源基因表达量的变化比2 mmol/L SA处理的要明显，16～20 h后表达量的变化值低于2 mmol/L SA处理的变化值，但2種浓度的SA处理后变化趋势相同，都是在16 h后达到了表达量的最高水平;而用MeJA处理，sm-Nvas同源基因表达量都升高，且16 h时表达量达到最大峰值而后迅速降低。相对而言，1 mmol/L处理的表达量要比2 mmol/L处理的表达量增加明显，可能是因为低浓度的激素诱导能力更强。在烟草Nicotiana attenuata中，SA处理后12 h表达量就开始增加达到最高值，而MeJA在16 h的表达量才是峰值。该研究结果表明，这2种激素处理16 h后，同源基因的表达量才出现下降，推测可能是激素已经被烟草自身降解消耗导致表达量迅速下降。有研究表明水杨酸（SA）和乙酰水杨酸（ASA）是茉莉酸（JA）诱导目标基因mRNA和蛋白质合成的有效抑制剂[14]。对拟南芥用SA和JA共同处理会导致JA介导的防御素基因诱导的丧失[15-16]。SA和JA之间存在相互拮抗作用，可能导致不同激素处理的烟草同源基因出现的峰值有所差异，烟草Nicotiana attenuata中的sm-Nvas同源基因可能优先参与的是SA途径，所以在12 h就能快速达到高峰。

损伤处理后，sm-Nvas同源基因表达量在8～12 h略有增加，但到了16 h开始下降，最终值比对照组还低。由于水杨酸和甲基茉莉酸参与植物体防御系统相关途径[17]，在损伤处理后sm-Nvas同源基因表达量也开始出现了一定量的升高，可以推测sm-Nvas同源基因可能与植物体的防御通路相关。番茄在受到机械损伤或是病虫侵害下，转录MYC2激活JA响应基因的表达，进而调控植物抗性[18]。其中的损伤修复转导途径需要乙烯和JA共同作用，在伤口反应过程中调节蛋白酶抑制剂基因的表达[19]。在接下来的工作中，将2种激素和损伤处理两两结合，进一步研究共同作用下sm-Nvas同源基因在RNA和蛋白质水平的表达情况，为研究其同源基因的生物学功能奠定基础。

参考文献

[1] 谭艳平，叶莲，何福收，等.烟草维管束发育相关基因Nvas启动子顺式作用元件鉴定[J].中南民族大学学报（自然科学版），2018，37（2）：31-35.

[2] 李静.SA和MeJA双重诱导的GT基因启动子5′-缺失体构建及其功能研究[D].武汉：中南民族大学，2007.

[3] 尚书凤，刘学群，周杰，等.1个烟草糖基转移酶启动子在拟南芥中的表达[J].华中农业大学学报，2009，28（3）：257-261.