济宁青山羊PRLR基因的多态性及其与主要经济性状的关联分析

张圆　袁婧　高一珊　康贝宁　李增宽　赵勇　闵令江

摘要 采用PCR-RFLP技术检测济宁青山羊PRLR基因部分序列的单核苷酸多态性，并分析其对济宁青山羊产羔数、出生重的影响，有利于进行分子标记辅助选择从而培育具有高繁殖力的济宁青山羊。结果表明，此次引物所扩增的片段具有多态性，有AA、AB 2种基因型;经χ2检验，该群体符合哈德-温伯格平衡。该基因位点对济宁青山羊产羔数没有显著效应（P>0.05），但是AB基因型产羔数比AA基因型多0.16只;该基因位点对济宁青山羊出生重没有显著效应（P>0.05），但是AB基因型出生重比AA型高0.38 kg。说明此次试验检测的PRLR基因的突变位点对济宁青山羊产羔数、出生重等性状的影响不显著。

关键词 济宁青山羊;PRLR基因;多态性;PCR-RFLP;经济性状;关联

中图分类号 S 827文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）16-0094-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.025

Polymorphism of PRLR Gene and Its Association with Major Economic Traits in Jining Grey Goats

ZHANG Yuan1，YUAN Jing2，GAO Yi-shan2 et al （1.Animal Husbandry Development Centre of Jining，Jining，Shandong 272000;2.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

Abstract PCR-RFLP technique was used to detect the single nucleotide polymorphism of some sequences of PRLR gene in Jining grey goats，and its effect on the number of lambsand and birth weight of Jining grey goats were analyzed，which was beneficial to molecular marker-assisted selection and to cultivate Jining grey goats with high fertility.The results showed that the fragment amplified by this primer was polymorphic，and the corresponding genotype were AA and AB.After χ2 test，the group conforms to the Hardy-Weinberg balance.The gene locus had no significant effect on the number of lambs produced in the Jining grey goats（P>0.05），but the genotype AB had 0.16 kids more than genotype AA;the gene locus had no significant effect on the birth weight of Jining grey goats （P>0.05），but the AB genotype birth weight was 0.38 kg higher than AA genotype.The results suggested that the mutation locus of PRLR gene in Jining grey goats in this experiment had no significant effect on the number of lambs，birth weight and other traits in this group.

Key words Jining grey goats;PRLR gene;Polymorphism;PCR-RFLP;Economic traits;Association

基金项目 山东省现代农业产业技术体系羊创新团队项目（SDAIT-10-08）;济宁市科技发展技术项目“济宁青山羊高繁殖力相关基因的筛选和应用”。

作者简介 张圆（1979—），女，山东济宁人，高级畜牧师，硕士，从事动物遗传育种与繁殖研究。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事动物生产与繁育研究。

收稿日期 2020-04-15

近年来，随着人们生活水平的不断提高，人们对于羊肉的需求量也日益增加，养羊业的方向也在发生转变，逐渐开始由皮用型转向肉用型。济宁青山羊主要產于山东省西南部的济宁市和菏泽市，目前已经推广到东北、西北、华南等多个省份以及地区，其性成熟早、繁殖率高、肉质细嫩、营养丰富、风味独特、适应性强，以产花纹独特的青猾子皮而出名[1]。济宁青山羊的肉色、大理石花纹、pH、系水力等各项指标均比白山羊、波白杂一代表现突出，而且含有较多的矿物质元素以及较低的脂肪，其营养价值是普通羊肉的1.8～2.6倍[2]。

山羊的产羔数是一个重要的经济性状，受多种因素影响，因此很难用常规的育种方法在短时间内来改良产羔数，随着分子生物学的不断深入研究，尤其是DNA分子标记技术的发展，寻找与产羔数、出生重等经济性状相关的主效基因和遗传标记成为了目前研究的热点[3]。一些与繁殖活动相关的激素、蛋白质因子以及受体所对应的基因均被列为候选基因进行研究，并取得了较大的进展[4]。考虑到催乳素受体（PRLR）基因在繁殖活动中的综合作用，国内外许多学者将PRLR 基因作为家畜特别是猪的繁殖性能的一个候选基因进行了大量研究[5]。

催乳素（PRL）是由垂体前叶分泌，控制乳腺发育、乳汁分泌和乳汁蛋白基因表达的肽激素[6]，可以促黄体维持妊娠，刺激母体做出保护幼崽的行为，促进胚胎着床，直接作用于雄性性腺调节睾酮的分泌，与雄性交配行为有关，影响动物机体免疫系统内各种细胞的增生和分化[5]。研究发现，催乳素发挥其生物学功能的第一步就是通过内分泌、旁分泌和自分泌的作用方式与靶细胞膜表面的PRLR相结合，从而引发各种生理生化反应[7]。据报道，PRLR是由2种不同的机制相互作用控制的，这些机制分别涉及催乳素或卵巢类固醇激素，或以组织特异性的方式组合使用，催乳素受体位点已被选定为候选基因[8]。

国内外学者对羊的PRLR基因与生长、繁殖行为的关联进行了大量的研究，但主要采用的是PCR-SSCP（聚合酶链反应-单链构象多态性）技术。此技术是利用不同构象单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动速率的差异快速有效地检测出DNA短片段中存在的单核苷酸突变的一项技术[9]。RFLP（限制性片段长度多态性）的基本原理是假如DNA序列中的某个碱基发生了突变，使突变所在部位的DNA序列产生或失去某种限制性内切酶的位点，再利用该限制性内切酶消化此DNA便会产生与正常不同的限制性片段，消化后的片段通过凝胶电泳依分子量的大小而分离，并形成连续的带谱[10]。PCR-SSCP技术是先用特定引物扩增基因组DNA，然后用适当的限制性内切酶酶切扩增产物，电泳检测多态性[10]。

该试验通过PCR-RFLP方法，检测济宁青山羊PRLR基因部分序列的单核苷酸多态性。与PCR-SSCP技术相比，PCR-RFLP方法简便、快速、可靠、经济实用，非常适合基层实验室使用。以济宁青山羊的子宫为材料，根据张跟喜等[11]发布的山羊PRLR 基因外显子10 和部分3′非翻译区的核苷酸序列以及研究结果（P2引物扩增出来的片段发生了2处突变即52G→A 和122G→A），利用NEBcutter 2.0软件，根据已经发布的PRLR核苷酸序列查找限制酶切位点，在51位点发现的MspI限制性内切酶的酶切位点。该试验从产羔数、出生重、子宫体长等多个方面分析其与PRLR基因的关联，对提高山羊产羔数、出生重的标记辅助选择以及培育高繁殖力的山羊品种具有参考意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器。金属浴，南京沃拓仪器设备有限公司;高速离心机，eppendorf生命科学公司;旋涡混匀器，IKA;超微量分光光度计，上海美谷分子仪器有限公司;Quick Drop超微量分光光度计，MOLECuLAR DEVICES;PCR仪，BIORAD;DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂;凝胶成像系统，北京科创锐新生物科技有限公司。

1.1.2 试验动物。该试验用到的济宁青山羊来自山东嘉祥济宁青山羊原种场，通过查阅系谱档案材料，选取连续3胎均产3羔或3羔以上的济宁青山羊14只，连续3胎均产单羔的济宁青山羊12只。该次试验取的是26只具有产羔数记载的年龄、体重基本一致，济宁青山羊的子宫冻存样品。

1.1.3 试验试剂。

上游引物、下游引物、DNA抽提试剂盒，购自上海生工生物工程有限公司;2×Phanta Max Master Mix，购自Vazyme科技有限公司;DNA Marker A（25～500）、核酸染料（4s Green Plus Nucleic Acid Stain），购自BBI生命科学有限公司;限制性内切酶Msp Ⅰ、10×NEBuffer，购自neb 公司;琼脂糖粉、ddH2O、无水乙醇、电泳缓冲液（1×TAE）、上样缓冲液（10×Loading Buffer）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品DNA提取和浓度测定。试验方法中的基因组DNA提取和测定等技术均参照《分子克隆实验指南》。

1.2.2 引物设计。

根据张跟喜等[11]发表的山羊PRLR 基因外显子10 及部分3′非翻译区的核苷酸序列设计引物，预期产物大小为233 bp，引物序列为：上游引物 F：5′-TGTCTGAAAAGTGTGATGAA-3′、下游引物 R：5′-AGCAATGTTGTGGTAAGAATA-3′。

1.2.3 PCR扩增。

1.2.3.1 PCR扩增反应体系（20 μL）。mix 10.0 μL，ddH2O 6.4 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2.0 μL。

1.2.3.2 最佳PCR反应条件。 95 ℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，最适退火温度48 ℃ 15 s共30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3.3 PCR产物检测。3%琼脂糖凝胶电泳分析，电压120 V，电流100 mA，电泳20 s，凝胶成像系统成像。

1.2.4 DNA的限制性內切酶反应。

1.2.4.1 酶切反应体系（15 μL）。10×NEBuffer 1.5 μL，限制性内切酶MspI 1.0 μL，PCR产物5.0 μL，ddH2O 7.5 μL。

1.2.4.2 酶切产物检测。3%琼脂糖凝胶电泳分析，电压120 V，电流100 mA，电泳20 s，凝胶成像系统成像，判断基因型。张跟喜等[11]用SSCP法测得部分个体该片段DNA在52位置发生了基因突变（G→A）。如果从图片上观察到2条片段，说明该个体没有发生突变，记为 AA基因型;如果从图片上观察到3条片段，说明该位点碱基突变，记为AB基因型。

1.3 数据统计分析

运用SPSS statistics 23进行最小二乘方差分析，以及不同基因型与济宁青山羊主要经济性状相关性分析，分析不同PRLR基因型与济宁青山羊产羔数、出生重、子宫角长、子宫体长的相关性。

2 结果与分析

2.1 济宁青山羊子宫DNA的浓度及纯度 试验结果显示，样品的A280/A260值基本都在1.8～2.0，A260/A230值在2.0～2.5，说明该试验所提取的济宁青山羊的DNA的浓度和纯度基本符合试验要求，可以进行下一步的PCR扩增试验。

2.2 济宁青山羊PRLR基因PCR扩增结果

配制3%的琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物。从图1可以看出，条带整齐、明亮，而且片段长度与预期的相符，扩增效果良好，可以直接进行下一步的限制性内切酶试验。

2.3 PCR-RFLP检测

配制3%的琼脂糖凝胶，电泳检测酶切产物。结果发现（图2），PCR扩增产物具有多态性，在这26个样品当中共检测到AA、AB 2种基因型。

2.4 基因型频率与基因频率

在检测的26只济宁青山羊中，14只为AA型，12只为AB型，由表1 可知，AA和AB型基因频率分别为0.538 5、0.461 5，A和B的基因频率分别为0.769 2、0.230 8。

2.5 PRLR基因的Hardy-Weinberg平衡检验

为了判断该济宁青山羊群体是否符合Hardy-Weinberg平衡，进行χ2检验，结果发现，χ2=1.21，P>0.05，说明该济群体符合Hard-Weinberg平衡。

2.6 济宁青山羊PRLR基因的不同基因型与产羔数的关联

从表2可以看出，该基因位点对济宁青山羊产羔数没有显著效应（P>0.05），但是AB型产羔数比AA型多0.16只，说明该突变位点对产羔数没有影响。

2.7 济宁青山羊PRLR基因的不同基因型与出生重的关联

由表3可见，该基因位点对济宁青山羊出生重没有显著效应（P>0.05），但是AB型出生重比AA型高0.38 kg，说明该突变位点对济宁青山羊的出生重没有影响。

2.8 济宁青山羊PRLR基因的不同基因型与子宫体、子宫角长度的关联

从表4可以看出，AA基因型个体子宫体长、子宫角长比AB基因型个体分别多0.738、0.358 cm，但是最小二乘均值分析结果表明该突变位点对子宫体、子宫角长度均没有影响（P>0.05）。

3 讨论与结论

3.1 PRLR基因的多态性

国内外学者对猪的PRLR基因研究较多，近年来关于羊的PRLR基因多态性研究也逐渐增多。Drogemuller等[12]研究不同品种的德国猪与产仔数有关的候选基因，结果发现催乳素受体基因存在多态性;牟玉莲等[13]采用PCR-SSCP技术检测催乳素受体基因在4个绵羊群体中的多态性，结果表明，有3对引物扩增片段存在多态性。该试验所扩增出的济宁青山羊PRLR基因部分序列，通过PCR-RFLP检测，结果发现存在多态性;该试验以济宁青山羊子宫为材料，采用PCR-RFLP技术，在该群体中共检测到AA、AB 2种基因型，但是没有检测到BB基因型;通过χ2适合性检验，济宁青山羊群体保持了Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），这可能是由于以下2个原因造成的：一是样本群体数量较少;二是人工选择和长期进化的结果。

3.2 PRLR基因与产羔数之间的联系

大量研究报道，PRLR基因与繁殖性状有关，尤其是与家畜的产仔数密切相关。Vincent等[14]研究发现4个猪品种PRLR基因中存在AluⅠ 的多态位点，AA 型母猪产仔数显著高于AB、BB型。曹果清等[15]利用PCR-SSCP技术检测4个品种猪催乳素受体基因第10外显子的多态性，结果发现，PRLR基因第10外显子存在NaeⅠ 多态位点，而且该位点对母猪产仔性能有显著影响。汪代华等[16]研究发现天府肉羊新品群PRLR 基因多态性与产羔数密切相关，AA 型和CC 型2 种纯合基因型在控制繁殖性能上具有显著的遗传效应。该试验当中，PRLR基因不同基因型与产羔数的最小二乘均值分析结果表明， AB型济宁青山羊的平均经产羔数比AA型多0.16只，但是二者差异不显著，这与张跟喜等[11]的研究结果一致。说明该试验通过PCR-RFLP技术检测到的济宁青山羊PRLR基因的突变位点对济宁青山羊遗传变异的影响较小，而且这个基因位点对该研究群体的产羔数的影响不显著。这与目前PRLR基因在繁殖性能方面研究的结果有一定的差别，出现这种情况的原因可能是：①该试验样本含量较少，而且所涉及的品种数也不多;②该试验存在一定的抽样误差;③该试验扩增的只是PRLR基因的部分序列，检测到的突变位点数量较少。

3.3 PRLR基因与其他性状之间的联系 近年来也出现了一些关于PRLR基因与家畜体重存在关联的报道。Zhang等[17]研究催乳素受体基因在F1杂交猪 （野猪×大白猪） 中的多态性，并分析了其与出生重、30 d体重的遗传相关性，结果表明，PRLR基因的AA 基因型與AB和BB相比具有较高的30 d体重 （P<0.05）;Xiong等[18]利用波尔山羊和麻城黑山羊品种，通过DNA测序检测PRLR基因中的单核苷酸多态性，分析不同基因型与生长性状的关联，结果表明，TT 或TC基因型的个体的出生重明显低于CC基因型的个体 （P<0.05）。该试验分析PRLR基因部分序列与济宁青山羊出生重的关系发现，AB型济宁青山羊的出生重比AA型高0.38 kg，但是2种基因型之间差异不显著（P>0.05），说明该位点对济宁青山羊的出生重没有影响。子宫是与济宁青山羊繁殖有关的器官，子宫的结构与子宫的功能有关，该试验分析PRLR基因部分序列与济宁青山羊子宫角长、子宫体长的关系发现，该位点对济宁青山羊的子宫体长、子宫角长没有影响。

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