脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155、XpertMTB/RIF水平在结核性脑膜炎诊断中的价值

2020-09-09 13:19孙万里鲁增辉蔡华锋周倩倩马苑王月
河北医药 2020年16期
关键词:脑脊液结核灵敏度

孙万里 鲁增辉 蔡华锋 周倩倩 马苑 王月

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是一种常见非化脓性炎症性疾病,由结核分枝杆菌感染神经系统所致,TBM发病率占全身结核病的6%,是肺外结核中最为严重的一类,致残率、致死率高,严重危害患者生命安全[1]。TBM早期症状不明显,脑脊液常规、生化改变不典型,易造成误诊和漏诊[2]。颅脑CT、MRI检查特异性低,涂片检查耗时长、灵敏度低且漏诊率高[3]。因此寻找敏感、特异指标对TBM早期诊断非常重要,对及时治疗、改善患者预后意义重大。腺苷酸脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)是嘌呤代谢中重要酶类,与机体细胞免疫活性有关,结核分枝杆菌感染后,可引发机体免疫功能紊乱,释放ADA[4]。γ-干扰素(interferonγ,IFN-γ)是免疫反应中关键细胞因子,可促进细胞免疫应答,在TBM免疫反应中发挥重要作用[5]。近来体液中微小RNA(microRNA,miRNA)成为一种新型诊断标志物,有研究报道mir-155在结合分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中其重要作用[6]。结核性脑膜炎/利福平耐药基因检测(XpertMTB/RIF)是由美国Cepheid公司研发的一种新型TBM及利福平耐药诊断技术,目前在临床上备受关注[7]。因此本研究拟探究脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155联合XpertMTB/RIF检测在结核性脑膜炎诊断中的价值,报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月至2019年1月本院收治的200例TBM患者为观察组,男103例,女97例;年龄18~75岁,平均年龄(42.75±11.58)岁。另取同期在本院进行脑脊液检查并经组织学、影像学技术确诊的非中枢系统疾病患者200例为对照组,男105例,女95例;年龄19~73岁,平均年龄(41.64±10.95)岁。2组患者性别比、年龄等一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。所有样品采集及资料调查取得患者及其家属知情同意并签字确认,本研究经过本院道德伦理委员会批准通过,符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①符合结核性脑膜炎的诊断标准[8];②临床资料完整;③自愿配合调查研究。

1.2.2 排除标准:①细菌、真菌、病毒等引起中枢系统感染者;②患有恶性肿瘤者;③肝、肾等重要脏器功能障碍者;④临床资料不全者。

1.3 主要试剂及仪器 Trizol试剂(货号:R0016,上海碧云天); PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)(编号:RR037A,TaKaRa)、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(编号:6210A,TaKaRa);人ADA ELISA试剂盒(货号:货号 PA1-27246,美国Invitrogen)人IFN-γELISA试剂盒(货号:PT518,上海碧云天);引物由广州锐博生物工程有限公司合成;紫外分光光度计(美国 Thermo Fisher公司)、RT-qPCR仪7500(美国Bio-Rad公司)等。

1.4 方法

1.4.1 脑脊液采集:无菌条件下,对受试者行腰椎穿刺,取脑脊液3 ml,3 000 r/min,有效离心半径10 cm,离心10 min,置于-80℃保存待检。

1.4.2 脑脊液细胞学检查:采用Olympus AV640 全自动生化仪检测脑脊液中白细胞计数、中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞比例。

1.4.3 脑脊液生化指标检查:采用FCS IV型微型脑脊液细胞玻片离心沉淀器(Thermo Fisher,美国)检查脑脊液中糖、氯化物及蛋白质含量。

1.4.4 脑脊液ADA、IFN-γ水平检测:采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑脊液ADA、IFN-γ水平,具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.5 脑脊液mir-155水平检测:采用Trizol提取脑脊液总RNA,用紫外分光光度计检测总RNA浓度及纯度。反转录得到cDNA,置于-20℃保存备用。采用实时定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测mir-155表达水平。RT-qPCR采用20 μl反应体系:TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl,ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4 μl ,cDNA(50 ng/μl)2 μl,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl,ddH2O 6.0 μl。反应采用两步法,条件设置为:95℃,30 s;95℃,5 s;60℃,34 s,40个循环;添加溶解曲线。mir-155上游引物(5’→3’):ACACTCCAGCTGGGCTCCTACACATATT,mir-155下游引物(5’→3’):CTCAACTGGTCGTGGA。内参U6上游引物(5’→3’):GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,U6下游引物(5’→3’):CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。采用2-ΔΔCT法对脑脊液中mir-155的相对表达水平进行定量分析。

2 结果

2.1 2组患者脑脊液细胞学检查结果比较 与对照组比较,观察组患者脑脊液中白细胞计数、中性粒细胞比例显著增加,淋巴细胞及单核细胞比例显著减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组脑脊液细胞学检查结果比较

2.2 2组患者脑脊液生化指标检查结果比较 与对照组比较,观察组患者脑脊液中糖、氯化物浓度显著降低,蛋白质浓度显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者脑脊液生化指标检查结果比较

2.3 2组患者脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平比较 与对照组比较,观察组患者脑脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平比较

2.4 脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平单独检测及XpertMTB/RIF检测对TBM诊断价值比较 分别以脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平为检测变量绘制ROC曲线,结果显示脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平诊断TBM的AUC分别为0.824、0.827、0.785,灵敏度分别为81.00%、90.50%、74.00%,特异度分别为86.00%、77.00%、70.00%。以临床诊断为金标准,四格表分析显示,XpertMTB/RIF检出TBM的灵敏度为57.00%,特异度为91.00%。见表4,图1。

图1 ROC曲线脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平对TBM的诊断价值

表4 四格表分析XpertMTB/RIF对TBM的诊断价值 例

2.5 脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF检测对TBM诊断价值分析 将脑脊液ADA或IFN-γ或mir-155或XpertMTB/RIF检测TBM阳性规定为联合诊断阳性。脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF诊断TBM灵敏度为93.00%,特异度为91.00%。见表5。

表5 脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155联合XpertMTB/RIF检出TBM的四格表 例

3 讨论

生理情况下,中枢神经系统存在血-脑脊液屏障,脑脊液被封闭在蛛网膜下腔,机体血液中蛋白质、糖及氯化物等物质可选择性透过血-脑脊液屏障进入脑脊液[9]。机体感染结核分枝杆菌时,脑膜、脉络丛和室管膜会发生炎性反应,造成脑脊液生成增多,蛛网膜颗粒吸收下降,血-脑脊液屏障受损,通透性增加,血液中蛋白进入脑脊液增多,糖代谢发生紊乱,脑底处破裂结核结节周围包含大量多核型白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等物质的渗出物向蛛网膜下腔扩散[10]。本研究结果发现TBM患者脑脊液中白细胞计数、中性粒细胞比例显著增加,淋巴细胞及单核细胞比例显著减少,提示TBM患者存在白细胞和中性粒细胞、蛋白质显著增多,淋巴细胞、单核细胞、糖及氯化物减少症状,符合TBM诊断标准。

机体感染结核分枝杆菌后,在巨噬细胞抗原提呈作用下,通过T淋巴细胞产生免疫应答反应,释放IFN-γ,IL-2等大量淋巴因子,其中IFN-γ在结核分枝杆菌感染的免疫反应中起重要作用[2]。张燕等[11]研究发现,TBM患者脑脊液中IFN-γ水平显著增加。吴长静[2]研究发现,结核分枝杆菌感染患者诱导T细胞IFN-γ释放反应,导致脑脊液IFN-γ水平显著升高。ADA是腺嘌呤核苷酸代谢关键酶,可催化腺苷生成肌苷,经尿酸排出体外。结核分枝杆菌感染突破血-脑脊液屏障后,刺激中枢神经局部免疫系统T细胞增殖、分化,可导致脑脊液中ADA活性升高[12]。汤海燕等[9]研究报道,结合分枝杆菌感染可引起脑脊液中ADA水平增加。mir-155位于非编码转录体bic外显子,通过调节T细胞分化、参与炎症及免疫应答反应[13,14]。柴璐璐等[6]研究发现,miR-155-5p在TBM患者脑血浆中表达上调。本研究结果发现,TBM患者脑脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平均显著高于对照组。综合以上研究及本研究结果提示脑脊液中ADA、IFN-γ、mir-155可能是TBM相关敏感指标,TBM患者免疫应答反应中T细胞增殖分化可能导致脑脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平升高,但对TBM的诊断价值有待进一步研究。

王永峰等[15]研究报道,动态监测脑脊液ADA水平可作为评价TBM患者预后质量的重要指标。杨泽伟等[3]研究报道,脑脊液ADA、IFN-γ对TBM有一定诊断价值。Wu等[16]研究报道,mir-155在TBM患者脑脊液中表达水平升高,有潜力成为TBM敏感诊断标志。XpertMTB/RIF是一种新型TBM诊断技术,可同时检测TBM和利福平耐药。研究发现,XpertMTB/RIF对痰标本具有较高的灵敏度和特异度,对肺结核诊断价值较高,但对肺外结核诊断价值研究较少[17,18]。本研究分析发现脑脊液ADA水平诊断TBM灵敏度低,IFN-γ诊断TBM特异度低、mir-155水平及XpertMTB/RIF检测诊断TBM灵敏度和特异度均不佳。因此本研究进一步对脑脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF对TBM的诊断价值进行分析,结果发现,灵敏度为93.00%,特异度为91.00%,显著高于单独检测的灵敏度及特异度,提示脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF检测可提高对TBM诊断的灵敏度和特异度,对TBM诊断有一定临床价值。

综上所述,脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF检测可提高对TBM诊断的灵敏度和特异度,对TBM诊断有一定临床价值。但由于本研究样本量少,结果可能具有局限性,脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF检测是否可应用于TBM临床诊断,尚需扩大样本量进一步验证。

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