血清lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1水平检测对卵巢癌的诊断及预后预测价值分析

周倩 郝烁月 陈凤 张海燕

卵巢癌是女性中最常见和最致命的恶性肿瘤，其发病率近年来逐渐增加[1,2]。 目前卵巢癌的主要治疗方法仍然依赖于化疗或放疗，随着生物技术和基因工程的发展，肿瘤发病过程中差异基因表达的研究可以促进个体化治疗和药物输送，从而使其成为癌症诊断、治疗的有效靶基因的关键[3,4]。lncRNA EWSAT1主要参与胚胎发育和血管生成的调节，其异常激活与肿瘤的发病机制和转移密切相关，lncRNA EWSAT1与c-met之间的结合激活细胞内酪氨酸激酶磷，进一步调节含有PI3K，ERK1/2和FAK的多个下游信号通路，从而调节肿瘤细胞的各种生物学功能[5]。先前的研究表明，lncRNA EWSAT1的上调可以降低细胞间粘附并促进细胞转移。SPRY4-IT广泛分布于细胞和组织中，通过与靶基因的完全互补结合发挥调节功能，直接降解靶基因mRNA或阻断转录后期或翻译期的基因翻译，发挥其癌基因和肿瘤抑制基因的功能，调节生物学行为，包括细胞增殖或凋亡，并与肿瘤的发生和发展密切相关[6,7]。目前关于血清lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1与卵巢癌诊断及预后预测价值分析较少。本研究拟探讨血清lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1在卵巢癌中的表达及其与临床病理特征的关系，为卵巢癌的诊断及预后预测价值分析提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年1月至2016年2月在我院行手术治疗并经病理证实的卵巢癌患者138例为病例组，年龄为40～74岁，平均(57.5±17.8)岁；病程9个月～4年；其中绝经70例，未绝经68例；未分化癌8例，子宫内膜样癌6例，透明细胞癌4例，混合型腺癌20例，浆液性腺癌82例，黏液性腺癌18例。所有患者行辅助检查：血常规、尿常规、血生化、卵巢病理组织检查。符合美国国家综合癌症网(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012版《Ovarian cancer,version 3.2012》中关于卵巢癌的诊断标准[8]。手术切除标本后行病理检查以判定肿瘤最大径、病理学分级、TMN分期、浸润深度、有无淋巴血管间隙浸润、有无淋巴结转移。选取同期本院健康体检者107例为对照组。患者及对照组自愿提供血清标本，用作分析血清lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1水平的表达。本研究经我院伦理委员会审批。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：既往无精神障碍史，无心理疾患或精神疾病史；所有参加本试验的人员(或其直系亲属)签署知情同意书。 排除标准：心功能不全，合并未控制的严重高血压；肝、肾、心功能异常者；呼吸道疾病、周围血管性疾病或栓塞性疾病者。

1.3 lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1 mRNA在卵巢及卵巢癌组织中表达的测定 TRIzol试剂(Invitrogen，美国)提取血清中总RNA，测定总RNA的浓度和质量。 然后使用lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA特异性反向引物逆转录总RNA(0.5 μg)以获得cDNA(lncRNA EWSAT1正向引物为：GTCGCCATGCAGGGTCCGAGGTATGCGACT；lncRNA EWSAT1反向引物为：CTCGCTTCGACATTGCCTACGAG；SPRY4-IT1 mRNA正向引物为：TCTACGAGGAGGAGATGCAGGTATGCGACT；SPRY4-IT1 mRNA反向引物为：AGTCATAGTCCTGGTCTTCTTCTCC)。反应体系为：正向引物10 μl、反向引物10 μl、RNA模版0.6 μl、超级酶混合物0.2 μl、2×μByr一步法RT-qPCR缓冲液5 μl、去RNA水3.4 μl。循环如下：95℃持续10 min，进行40个循环，持续15 s温度60℃。Fast Synergy Brands Green Master Mix法在ABI 7 500实时qPCR上测定miR-20a、BCL-2的相对水平。系统(Thermo Fisher Scientifc)，以U6作为内部对照，以2-ΔΔCt作为计算方法，依据lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1 mRNA 2-ΔΔCt计算结果，确定lncRNA EWSAT1>3.51，SPRY4-IT1>6.48为阳性。

2 结果

2.1 2组一般情况比较 2组在是否绝经、年龄、身高、体重、TG、HDL-C、LDL-C、舒张压、收缩压等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组一般情况比较

2.2 2组血清lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA水平比较 病例组血清lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组血清lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA水平比较

2.3 lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA阳性率与卵巢癌患者临床特征相关性分析 lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA阳性率与肿瘤大小、病理学分级、临床分期、有无淋巴结转移、是否复发相关性明显，且肿瘤越大、病理学分级越高、临床分期越高、有淋巴结转移、复发，lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA阳性率越高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA阳性率与卵巢癌患者临床特征相关性分析 例(%)

2.4 lncRNA EWSAT1+SPRY4-IT1联合筛查方法与lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1单独筛查方法灵敏度、特异度、准确度比较 lncRNA EWSAT1+ SPRY4-IT1联合筛查方法灵敏度、特异度、准确度均高于lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1单独筛查方法，差异有统计学意义(P<0.05)；lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1单独筛查方法灵敏度、特异度、准确度相近，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 lncRNA EWSAT1+SPRY4-IT1联合筛查方法与lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1单独筛查方法灵敏度、特异度、准确度比较 %(例)

2.5 lncRNA EWSAT1、 SPRY4-IT1表达水平与卵巢癌患者预后分析 lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1阴性组3年生存率及生存期均明显高于lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1阳性组(P<0.05)。见表5。

表5 lncRNA EWSAT1、 SPRY4-IT1表达水平与卵巢癌患者预后分析

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统中除了宫颈癌和子宫癌之外最常见的恶性肿瘤之一，其发生代表了具有家族遗传特性的复杂过程，卵巢癌癌细胞迁移、浸润效力高直接导致患者相对高的死亡率，严重威胁卵巢癌患者的预后[9-11]。多项研究表明，肿瘤的发病过程常伴有癌组织、细胞相关基因和蛋白因子的过度表达，在乳腺癌，肺癌和肝癌组织中lncRNA EWSAT1过度表达，其通过酪氨酸激酶活性，加强癌细胞与内皮细胞的粘附，进而促进细胞迁移和侵袭[12]。此外lncRNA EWSAT1与HGF的结合进行蛋白质磷酸化，激活肿瘤的各种信号通路，例如Raf/MAPK，PI3K和JAK /STAT，进一步调节肿瘤细胞增殖，分化，迁移和渗透效力[13,14]。因此，lncRNA EWSAT1在肿瘤的发生和发展中起关键作用。本研究结果显示，病例组血清lncRNA EWSAT1水平明显高于对照组，差异有统计学意义；lncRNA EWSAT1 mRNA阳性率与肿瘤大小、病理学分级、临床分期、有无淋巴结转移、是否复发相关性明显，且肿瘤越大、病理学分级越高、临床分期越高、有淋巴结转移、复发，lncRNA EWSAT1mRNA阳性率越高，差异有统计学意义；这与上述结论符合，同时也提示lncRNA EWSAT1可能为卵巢癌的诊断、治疗靶点。研究表明，lncRNA EWSAT1 诊断原发性肝癌的敏感性较高，约在73%～85%，而若将lncRNA EWSAT1的阳性阈值提高20%～30%，其诊断的敏感性和特异性分别将提高5%～8%[15]，本研究结果显示，lncRNA EWSAT1对卵巢癌患者的筛査是有效的，其诊断卵巢癌的灵敏度、特异度、准确度分别为78.20%、79.40%、78.70%，可作为卵巢癌的血清学预警指标物。

生物信息学方法发现SPRY4-IT1在正常肝细胞中低表达或表达，而在肿瘤转化的情况下，SPRY4-IT1立即表现出异常高表达[16]。因此，通过检测患者体内SPRY4-IT1表达情况，并靶向阻断SPRY4-IT1/c-met途径，降低SPRY4-IT1表达是抑制肿瘤进一步进展的有效措施[17]。研究同时发现SPRY4-IT1在各种癌细胞的增殖，凋亡和迁移中发挥调节功能。例如SPRY4-IT1通过介导p53信号通路调节癌细胞行为，而SPRY4-IT1通过肺组织中肿瘤抑制基因sprouty 2的表达影响肺癌的发病、进展20-23；SPRY4-IT1在多种肿瘤细胞表达及相关调控机制中的研究基础提供了它作为临床上有效诊断及治疗癌症的生物治疗靶点。本研究结果显示，病例组血清SPRY4-IT1水平明显高于对照组，差异有统计学意义；SPRY4-IT1 mRNA阳性率与肿瘤大小、病理学分级、临床分期、有无淋巴结转移、是否复发相关性明显，且肿瘤越大、病理学分级越高、临床分期越高、有淋巴结转移、复发，SPRY4-IT1阳性率越高，差异有统计学意义；这与上述结论符合，说明 SPRY4-IT1可能为卵巢癌的诊断、治疗靶点；本研究结果显示，SPRY4-IT1诊断卵巢癌的灵敏度、特异度、准确度分别为68.80%、83.10%、76.30%，其具有较高的诊断效力，可作为诊断卵巢癌的敏感生物学标志物。

本研究同时发现，lncRNA EWSAT1+ SPRY4-IT1联合筛查方法灵敏度、特异度、准确度均高于lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1单独筛查方法，差异有统计学意义；lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1单独筛查方法灵敏度、特异度、准确度相近，差异无统计学意义；lncRNA EWSAT1、 SPRY4-IT1阴性组3年生存率及生存期均明显高于lncRNA EWSAT1、 SPRY4-IT1阳性组。说明lncRNA EWSAT1+ SPRY4-IT1联合筛查方法诊断卵巢癌灵敏度、特异度、准确度高，适合在临床上推广应用；lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1低表达的卵巢癌患者具有较好的预后。

综上所述，卵巢癌患者血清lncRNA EWSAT1、 SPRY4-IT1升高；ncRNA EWSAT1+ SPRY4-IT1联合筛查方法诊断卵巢癌灵敏度、特异度、准确度高，适合在临床上推广应用；lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1低表达的卵巢癌患者具有较好的预后。