不同硬化剂治疗后兔血管内皮及其周围组织病理变化*

刘翔宇，魏 志，孙自勤

1.山东省济宁市第一人民医院消化内科(济宁272000)；2.山东省立医院西院区消化内科(济南 250031)；3.中国人民解放军联勤保障部队第九六零医院消化内科(济南 250031)

食管胃静脉曲张(Gastroesophageal varices，GOV)约见于50%肝硬化患者，是肝硬化门脉高压症的常见并发症之一[1-2]。食管胃静脉曲张破裂出血(Esophagogastric variceal bleeding，EVB)患者病死率高，是消化系统的急危重症之一[3-4]。目前内镜下治疗食管胃静脉曲张的方法主要有内镜下硬化剂注射治疗和内镜下曲张静脉套扎术。常用于GOV治疗的硬化剂为聚桂醇注射液[4-5]。近年来，泡沫硬化剂也逐渐得到了大家的重视，目前在下肢静脉曲张、血管畸形的治疗中已广泛应用[6-7]，但是在GOV的治疗中应用较少。本研究通过观察不同硬化剂、不同注射方式以及不同时点下实验动物血管壁及其周围组织病理变化情况，为临床选择硬化剂、治疗方式提供理论依据。

材料与方法

1 实验动物 普通级新西兰大白兔86只，2月龄，雌雄不限，体质量2～2.5 kg，按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

2 实验试剂 聚桂醇注射液(国药准字H20080445)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)鼠单克隆抗体等。

3 实验方法

3.1 动物分组：取兔耳缘静脉171支，分为聚桂醇组(81支)、泡沫硬化剂组(81支)和生理盐水组(9支)。①聚桂醇组：又分为血管内注射(27支，聚桂醇注射液0.2～0.3 ml血管内注射，不压迫血管)、血管旁注射(27支，聚桂醇注射液0.1 ml血管旁皮下多点注射)和联合注射(27支，聚桂醇注射液0.2～0.3 ml血管内注射，0.1 ml血管旁皮下多点注射)。②泡沫硬化剂组：将聚桂醇注射液与空气按1∶4比例混合制备泡沫硬化剂[8-11]。注射方式以及剂量同聚桂醇组。③生理盐水组：生理盐水0.2～0.3 ml血管内注射，不压迫血管。

3.2 标本制作及观察分析：分别于注射后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、72 h、120 h、168 h取兔耳缘静脉及血管周围组织作为标本。所有标本均固定、包埋，进行HE染色和免疫组化染色。对蜡块连续切片各5张，在高倍镜(10×40倍)下随机选取5个非重合的视野进行观察，棕黄色或黄色为阳性细胞。采用Biosens Digital Imaging System V1.6图像分析系统进行VEGF光密度分析，取平均值。

结 果

1 聚桂醇组注射后的组织病理学变化

1.1 HE染色：注射聚桂醇注射液3 h后，兔耳缘静脉均出现血管内皮细胞增生、排列紊乱，伴少量炎细胞浸润。24 h后，内皮细胞破坏，血管周围组织细胞出现轻度水肿，联合组较其他两组更明显。72 h后，出现血小板聚集伴明显炎细胞浸润。120 h后，血小板呈网格状聚集，内充红细胞，血栓开始机化。168 h后，血管壁及血管周围纤维化，血栓机化，联合组出现更早。见图1。

1.2 免疫组化染色：VEGF平均光密度在不同注射方式下均表现为先上升后下降，其上升峰值出现在注射后72 h。联合注射上升更明显，血管旁注射次之。相同注射方式下各时段间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。同时段不同注射方式间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。同时段不同注射方式间两两比较，血管内注射与血管旁注射、联合注射相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；血管旁注射与联合注射相比，差异无统计学意义(P=0.095)。见表1(图2)。

表1 聚桂醇组各时段VEGF平均光密度

2 泡沫硬化剂组注射后的组织病理学变化

2.1 HE染色：病理变化与聚桂醇组基本一致，但炎症反应较聚桂醇组轻微(图3)。

2.2 免疫组化染色：VEGF平均光密度变化趋势与聚桂醇组基本相似，峰值也出现在注射后72 h。联合注射上升趋势更明显，血管旁注射次之。相同注射方式下各时段比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。同时段不同注射方式间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。同时段不同注射方式间两两比较，血管内注射与血管旁注射、联合注射相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；血管旁注射与联合注射相比，差异无统计学意义(P=0.095)。见表2(图4)。

3 生理盐水组注射后的组织病理学变化 HE染色下，镜下未发现血管壁损伤及血栓形成。免疫组化染色下，VEGF平均光密度各时段比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 泡沫硬化剂组各时段VEGF平均光密度

4 相同注射方式下不同硬化剂组间VEGF平均光密度两两比较

4.1 血管内注射：聚桂醇组分别与泡沫硬化剂组和生理盐水组比较，泡沫硬化剂组与生理盐水组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

4.2 血管旁注射：聚桂醇组与泡沫硬化剂组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

4.3 联合注射：聚桂醇组与泡沫硬化剂组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

自Cassaigness于1853年首先提出硬化剂疗法以来，采用硬化剂治疗静脉曲张已有150多年的历史。泡沫硬化剂的概念在1944年由Orbach最先提出。目前在下肢静脉曲张的治疗中，多已采用泡沫硬化剂。有研究[12]表明，泡沫硬化剂与液体硬化剂相比效果更好，但副作用没有明显增加。

为了解不同注射方式及不同硬化剂注射后血管内皮细胞的变化及血管周围的微血管增生情况，本研究选择VEGF的表达进行研究，对HE染色及免疫组化结果综合分析。结果发现注射聚桂醇注射液后VEGF的表达表现为先上升后下降，注射后72 h表达最高；各时段之间比较，差异有统计学意义。不同注射方式间比较，联合注射上升最快，VEGF表达最高，下降较缓慢，血管旁注射次之，血管内注射最低。各注射方式间比较，VEGF表达差异有统计学意义；两两比较时，血管内注射VEGF表达与血管旁注射、联合注射比较，差异均有统计学意义，但血管旁注射和联合注射比较无统计学差异。

有文献[13-14]报道，聚桂醇注射液以黏膜下注射为主，因为静脉旁注射引起周围组织水肿及炎症的作用迅速，并促进成纤维母细胞的增生，而黏膜下注射基本不破坏血管内皮，且不易形成血栓。同时，在本研究中血管旁注射和联合注射中均发现血管周围大量成纤维细胞增生。张春荣等[15]在SD大鼠气管黏膜下注射1%乙氧硬化醇0.05 ml后，分别于第1、3、5、7天行VEGF免疫组化染色及电镜观察，结果发现黏膜下层VEGF的表达增加，其表达在第3～5天达到最高峰，且电镜下观察发现第3天开始细胞周围的胶原纤维较以往增多，第5天胶原纤维增生明显且排列整齐，第7天胶原纤维排列致密，本研究中VEGF表达的变化过程与其相一致。

与液体硬化剂相比，泡沫硬化剂具有其独特的优点[16-18]：首先，泡沫使其与血管内膜的接触面积增大，在相同剂量下可以达到更好的效果；其次，泡沫硬化剂易于分布在血管内皮表面，可使其与血管的接触时间延长；最后，泡沫硬化治疗可以在超声引导下进行。本研究发现，泡沫硬化剂注射后血管病理变化与聚桂醇注射液基本一致，但是血管内损伤、炎症情况都较聚桂醇注射液轻微。因此，虽然两种硬化剂均具有血管损伤轻、硬化止血效果好、组织修复快等优点，都可以供临床选择。但泡沫硬化剂的血管损伤更轻微，周围组织恢复更快，应作为首选的硬化剂。

在注射方式的选择方面，杨培生等[19]在研究大鼠的股静脉在不同硬化剂注射后的病理变化时发现，血管内注射和黏膜下层注射联合应用时可以发挥其相互协同的作用：①可以减少注入血管的硬化剂的量；②血管旁注射后血管受到挤压，可以使血管压力下降。本研究中，联合注射在组织学和VEGF平均光密度的趋势上明显优于血管内注射及血管旁注射，故联合注射可作为首选的注射方法。

综上所述，聚桂醇及其制备的泡沫硬化剂都是理想的硬化剂。与聚桂醇注射液相比，泡沫硬化剂具有血栓形成快、组织损伤小、组织修复快等优点。在注射方式上血管内联合血管旁注射更具有优势。