血浆热休克蛋白90α联合临床特征对非小细胞肺癌EGFR突变的预测价值

许 露，郭 嘉，吴海波，高 敏，徐方舟，张妍蓓

在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中，最为重要的分子靶向基因是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)[1]。目前常用的基因突变检测方法: 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)、Sanger测序法、下一代测序技术(next-generation sequencing technology, NGS)等，因受限于标本的来源、检测技术要求高及费用昂贵等因素的影响，目前难以普及开展。特异性血浆肿瘤标志物对恶性肿瘤患者的诊断具有重要作用，且取材方便、检测速度快、患者配合度高，更加适用于肺癌突变基因的早期筛检。热休克蛋白90(heat shock proteins90, HSP90)是一种新发现的具有分子伴侣功能，腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP) 依赖的，高度保守的蛋白质，其在细胞内与多种细胞周期信号通路中的关键蛋白酶相互作用，调控细胞的生存、分化及代谢等重要生理过程[2]。有研究表明，肺癌及其他实体肿瘤患者的血浆HSP90α表达水平显著高于健康人群。说明血液HSP90α在肺癌的早期筛检中有一定作用[3]。

目前尚无血浆HSP90α联合临床特征预测NSCLC患者EGFR基因突变的研究，因此，该文回顾性研究患者治疗前HSP90α浓度联合性别、肿瘤分期及转移的接受者操作特性曲线 (receiver operating characteristic curve, ROC)，旨在探索四者联合对NSCLC患者EGFR基因突变的预测价值。

1 资料与方法

1.1 病例资料收集89例于2016年3月14日～2019年10月1日就诊于安徽医科大学第一附属医院行经支气管镜肺活检术(transbronchial lung biopsy, TBLB)或CT引导下经皮穿刺肺活检术(percutaneous aspiration lung biopsy, PALB)进行病理学确诊并行基因检测的NSCLC患者。其中男性50例，女性39例，年龄为30～89(64.12±11.084)岁；腺癌71例，鳞癌10例，未分类8例；临床分期为 I～ⅢA期14例，ⅢB～Ⅳ期75例；发生远处转移为66例，23例无远处转移；患者中39例有EGFR突变，50例无EGFR突变。所有入选患者均为首次诊断；无其他肿瘤疾病史及肝、肾等重要脏器严重病变，无内分泌代谢紊乱史。

1.2 HSP90α浓度测定患者均在入院第2天空腹使用EDTA抗凝管采集静脉血2 ml，于4 ℃, 3 000 r/min, 离心10 min，分离血浆，并于- 80 ℃ 冻存。所有标本统一解冻后，应用ELISA检测血浆HSP90α浓度，具体检测方法严格按说明书进行。其定量检测试剂盒、酶免分析仪均由烟台普罗吉生物科技发展有限公司提供。HSP90α正常参考值范围为：0～82.06 ng/ml。

1.3 EGFR基因检测血液/组织基因组按照DNA提取试剂盒提取，由天根生化科技(北京)有限公司提供。利用天津诺禾致源生物科技有限公司提供的实体瘤靶向用药基因建库试剂盒(仅供科研使用)构建文库。使用美国Illumina公司的测序高通量测序上机测序试剂盒对多位点文库进行测序。

2 结果

2.1 临床特征与EGFR基因突变的分析将患者的不同临床病理特征分组，进而比较EGFR基因检测结果发现， EGFR突变率与患者的性别、肿瘤转移及分期均有相关性，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 EGFR突变与临床病理特征的关系[n(%)]

2.2 HSP90α与EGFR突变的关系分析将HSP90α表达水平与正常参考值范围比较，分为正常组及异常组，分析两组HSP90α不同表达水平与EGFR基因的关系。数据分析发现EGFR突变与HSP90α的水平升高有关。详见表2。

表2 EGFR与HSP90α 异常表达水平的关系[n(%)]

按不同HSP90α浓度梯度分组进行统计分析，结果显示不同浓度的HSP90α与EGFR突变有统计学意义，且HSP90α表达水平越高，EGFR基因突变率越高。详见表3。

表3 不同HSP90α浓度与EGFR检测结果的比较[n(%)]

2.3 HSP90α联合临床特征预测EGFR突变采用ROC 曲线分析比较89例NSCLC患者的HSP90α浓度及性别、临床分期及转移单独或联合诊断EGFR 突变的效能。见图1。

图1 血清中HSP90α及临床特征单一或联合对EGFR突变诊断的ROC曲线

HSP90α浓度及性别、临床分期及转移联合诊断的ROC曲线AUC为0.848，在临界值时的敏感度为0.795，特异度为0.740。可见HSP90α浓度及性别、临床分期及转移四项联合检测可以提高EGFR突变诊断的效能。见表4。

2.4 HSP90α水平与各临床特征之间的关系比较不同临床特征的患者HSP90α表达水平的差异，结果显示仅患者是否转移组别间HSP90α的表达水平存在差异，有转移者HSP90α表达水平异常率较高，其他不同临床特征的患者HSP90α表达水平无差异。详见表5。

表4 临床特征与血浆HSP90α浓度对EGFR突变的诊断价值比较

表5 临床特征与血浆HSP90α浓度表达水平差异的比较[n(%)]

3 讨论

随着基因检测手段的发展和精准医疗概念的推广，肺癌的治疗模式已转向靶向特定信号通路中的相关异常分子。EGFR是一种分布于上皮细胞表面的跨膜糖蛋白，由胞外配体结合区、跨膜区和胞内酪氨酸激酶结合区组成。据统计[4], EGFR基因敏感突变在晚期NSCLC患者中的发生率约为10%～20%。近年来，针对EGFR基因的治疗在临床取得了显著的疗效，比传统的化疗方案更能够显著延长患者的中位生存期，引领了肺癌靶向治疗的前行步伐。有研究[5]表明，EGFR基因突变在亚洲、女性、不吸烟及腺癌的患者中发生率更高，EGFR基因突变患者相对更易出现转移，最常见的是骨转移与脑转移[6]，亦说明肿瘤分期越晚EGFR基因突变的机率越大。本研究数据表明EGFR基因突变率在女性、ⅢB～Ⅳ期、转移的患者(58.97%、49.33%和54.55%)高于男性、I～ⅢA期患者、无转移患者(32.00%、14.29%和13.04%，P<0.05)，与以往研究结果一致。

HSP90是一类分子质量约为90 ku的同二聚体蛋白，在NSCLC患者中高表达，其升高与年龄、既往吸烟史、淋巴结转移呈正相关[7]，可以预测患者的预后。HSP90α是 HSP90 亚型中唯一可以在血浆中被检测到的。我们的研究显示HSP90α高表达与NSCLC患者发生转移有关(P=0.027)，已有的研究[8-9]表明在胃癌、肝癌、乳腺癌患者中，将无转移灶患者和发生转移患者的血浆HSP90α水平进行比较，在发生转移的患者中血浆HSP90α明显增高。

已知HSP90α的底物蛋白有200多种，其中包括EGFR、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2, HER-2)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)等，在细胞中充当细胞因子，参与细胞的各种生命活动[10]。HSP90α在肿瘤发生发展过程中起到了维持EGFR功能稳定的作用，在多种肿瘤组织中表达增高，参与肿瘤进展的许多关键环节[11]。在本研究中，当HSP90α表达水平异常升高(HSP90α>82.06 ng/ml提示异常)情况下，患者EGFR突变风险高于正常值(P=0.025)，说明HSP90α升高与EGFR的突变正相关。本研究数据分析还发现，随着浓度的升高，EGFR基因突变率呈上升趋势(P=0.007)。

有研究[12]显示检测HSP90α有助于评估NSCLC患者化疗疗效并指导治疗。亦有研究[13]证实HSP90抑制剂与EGFR-TKI联合使用，可使抑制肺癌细胞增殖及诱导细胞死亡的作用加强。故HSP90α高水平表达与EGFR突变之间存在关联。因基因检测操作技术有创且费用昂贵，在我国基因检测率尚不高。 因此，研究HSP90α及临床特征来预测EGFR基因突变也是有意义。本研究分析，发现HSP90α对于预测EGFR基因突变的敏感度尚可，但特异度欠佳，可能与HSP90α异常高水平表达时，才与EGFR突变正相关，同时本研究的病例中HSP90α异常比例相对较低，不排除存在选择偏移的影响。如果综合性别、肿瘤分期、转移和HSP90α来预测EGFR基因突变情况，可见敏感度提高(79.5%)(P<0.001)，这说明综合临床特征预测EGFR基因突变中血浆HSP90α起很重要的作用。

临床中患者为女性，分期为ⅢB～Ⅳ期，有局部转移，且HSP90α超过82.06 ng/ml，根据研究的预测模型，可指导疑似突变患者进一步行病理检测确诊，对于难行病理活检的患者可考虑应用靶向治疗。因EGFR基因突变检测也存在异质性,部分检测阴性的患者,也能从靶向治疗中获益。因此，如果符合该预测模型中的各个因素，考虑EGFR突变可能性较大，可指导进一步确诊或靶向治疗。