SARS-CoV-2经结膜感染与结膜炎研究述评

刘 晶，冯 俊

0引言

新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)因2019-12发生在中国武汉的不明原因病毒性肺炎病例而被发现[1]。相关病原学和发病机制尚不明确，从现有武汉市不明原因肺炎患者下呼吸道分离出的SARS-CoV-2是一种属于β属的新型冠状病毒，基因特征与严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)有明显区别，是现已发现的第七种可感染人类的β冠状病毒种属[2]。流行病学显示SARS-CoV-2具有人群普遍易感的特点，临床以发热、乏力、干咳为主要症状，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状[3]。如今我国疫情已经得到基本遏制，但由于欧美多国疫情的爆发，世界卫生组织在2020-03-11正式宣布新型冠状病毒感染的肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)成为全球大流行病，疫情进入全球大流行阶段，严重威胁到世界人民的健康与生命。由于缺乏特效药，切断传播途径仍然是控制疫情最有效的方式。有报道称结膜炎可作为COVID-19患者的首发症状[4]，自此结膜传播作为潜在传播途径引起广泛重视。相关专家也指出眼表传播的风险不容忽视[5]。目前已有多项研究陆续开展，但受多种因素的影响研究结果存在明显不一致性，我们将从现有的相关案例和报道入手探讨SARS-CoV-2经结膜感染与结膜炎的关系。

1人眼结膜暴露在空气中，极易感染病毒

尽管目前诊疗意见中未明确指出结膜是SARS-CoV-2的传播途径[3]，但结合人眼解剖特点，结膜大部分暴露在外界，易受外界环境的刺激和微生物感染而发病，由此推测结膜极有可能是SARS-CoV-2感染的入口之一，病毒传播风险极高。而且结膜上皮与角膜上皮、泪道黏膜上皮及泪腺开口的上皮相延续，又通过鼻泪管与呼吸道和消化道相连，所以结膜在感染后可快速传播至其他部位。研究也证实呼吸道病毒可利用眼表作为病毒复制的场所和进入呼吸道的入口，当人眼结膜暴露在具有传染性的气溶胶或接触污染物时，不仅引起眼部感染，还可进一步引发呼吸道感染[6]。所以人眼结膜在感染SARS-CoV-2后不仅激发了局部免疫机制引发结膜炎，还进一步传播至呼吸道和消化道，引发全身症状。尽管人眼结膜极易接触到SARS-CoV-2，但结膜炎并不是COVID-19患者较为常见的症状，而且何种情况以及多少病毒载量可使COVID-19患者出现结膜炎症状还需进一步研究。

2眼结膜存在ACE2受体，可与SARS-CoV-2相结合

目前研究已经发现冠状病毒进入人体需与特异性受体相结合，其趋向性主要取决于刺突进入蛋白与细胞表面受体结合的能力[7]。现已证实受体-血管紧张素转化酶2(angiotension-converting enzyme 2，ACE2)是SARS-CoV-2的特异性受体，与SARS-CoV类似。Zhou等[8]研究发现SARS-CoV-2可结合人类、蝙蝠、果子狸和猪来源的ACE2受体，但无法结合不含ACE2的细胞；同时还证实SARS-CoV-2不能结合冠状病毒其他常用受体(APN和DPP4等)。尽管SARS-CoV-2的受体作用机制及作用时间还待进一步研究，但我们可以通过人体中ACE2的表达分布，推测SARS-CoV-2潜在的感染途径和体内传播及复制路线。研究已证实人角膜和结膜组织中存在ACE2，但表达量较人心和肺组织少[9]。而此前SARS-CoV的体外实验不仅证实了SARS-CoV可与人眼结膜、角膜的ACE2受体特异性结合，还发现人眼结膜、角膜与病毒的结合力较心肺组织的弱，这可能与人眼结膜上ACE2的表达量少有关[10]。相关研究也证实ACE2表达量与细胞和SARS-CoV S蛋白的结合能力有相关性[11]，进一步提示SARS-CoV-2有感染眼部引发结膜炎的风险。但人眼结膜、角膜ACE2的表达量少，与SARS-CoV-2的结合力相对较弱，可能留存于眼表的时间较短，极易被机体免疫清除，故而引起的结膜炎症状相对较轻，持续时间较短，多可自愈。

3目前关于SARS-CoV-2与结膜炎的临床研究结果存在不一致性

2020-01-22，全国肺炎专家小组成员王广发主任确诊COVID-19，回顾病史发现其感染可能与未行眼部防护有关。在发热前1d出现左眼下睑红、疼等结膜感染症状，并首次提出结膜可能是SARS-CoV-2的传播途径，需重视眼部防护及观察COVID-19患者的眼部症状[5]。眼科专家随后也提出警惕SARS-CoV-2经眼传播的风险[12]。为证实这一风险，临床逐步开展了对结膜分泌物及泪液的SARS-CoV-2核酸检测。目前已有多个临床研究探讨结膜炎与SARS-CoV-2的关系，但结论存在不一致。叶娅等[13]在临床观察的30例COVID-19患者，发现有3例合并结膜炎，1例以结膜炎为首发症状，但未行病毒检测。临床表现以轻中度为主，有眼红、眼痛、异物感、黏性或水样分泌物增多等症状，予局部抗病毒液治疗7～10d后症状消失。在无结膜炎的患者中，有2例结膜拭子SARS-CoV-2核酸检测结果为阳性。由于该研究报道较早，未行全面的SARS-CoV-2核酸检测，结论仅指出少数COVID-19患者可伴有眼表感染症状，未能说明SARS-CoV-2与结膜炎的关系。而李雪杰等[14]观察的92例COVID-19患者中，仅对5例有轻型结膜炎症状患者的结膜分泌物行病毒核酸检测，发现1例阳性结果。该研究也发现1例以结膜炎为首发症状的COVID-19患者，但双眼结膜拭子病毒核酸检测为阴性，该患者在结膜炎症状基本消失后出现发热、咳嗽等全身症状。结果指出眼表可能存在SARS-CoV-2，且与结膜炎有关，但仍需进一步验证。也有研究并不支持结膜为SARS-CoV-2的传播途径。Zhou等[15]对纳入的67例COVID-19患者进行了鼻咽和结膜拭子的逆转录聚合酶链反应(reverse-transcriptase-polymerase-chain-reaction，RT-PCR)检测。检测结果仅有1例阳性，2例可疑阳性，均无眼部症状。其中1例以结膜炎为首发症状的患者，但RT-PCR检测结果为阴性。故该研究并不支持结膜是SARS-CoV-2的传播途径。为确保研究结果的准确性，Xia等[16]对30例已确诊的COVID-19患者的泪液和结膜分泌物进行2次检测，取样间隔2～3d。仅发现1例有结膜炎症状的患者，检测结果均为阳性。由于并未在COVID-19非结膜炎患者的泪液和结膜分泌物中检测出病毒RNA，该研究提出非结膜炎患者的泪眼和结膜分泌物可能不存在病毒，故不具有传染性。而合并结膜炎的COVID-19患者，泪眼及结膜分泌物中存在病毒，具有传染性。但Sun等[17]观察的72例COVID-19确诊患者，有2例患者被诊断并发结膜炎，其中1例并发结膜炎患者的眼表分泌物的SARS-CoV-2 RT-PCR检测结果为阳性，由此推测在合并结膜炎的患者中，其结膜中可能并不一定存在SARS-CoV-2。而该研究也指出眼部感染SARS-CoV-2的风险极低，但职业性暴露后通过眼部的院内感染是一种潜在的感染途径，建议所有医护人员以配戴防护眼镜来降低SARS-CoV-2的院内感染。新加坡一项最新的研究观察了17例确诊患者，仅有1例出现眼部症状。与其他研究不同的是该研究采用了Schirmer试纸法采集泪液，未得出阳性结果，而且该研究也未分离和培养出获得SARS-CoV-2病毒株。所以该研究也指出泪液传播SARS-CoV-2的风险极低[18]。

目前对COVID-19患者结膜炎的发病率也存在明显差异。Guan等[19]观察了1099例COVID-19患者的临床特征，仅发现9例(0.8%)患者出现结膜充血症状。为提高结果的准确性，Chen等[20]通过调查问卷等方式询问了534例COVID-19患者，发现25例(4.68%)有结膜充血症状，3例为首发症状，平均充血时间为4.9±6d。但该研究发现COVID-19患者的3大眼部症状是干眼(112例，20.97%)、视力模糊(68例，12.73%)和异物感(63例，11.80%)，并不包含结膜炎症状。该研究中有322例COVID-19患者有手眼接触史，但并未都出现眼部感染症状。此外该研究指出其观察的结膜炎发病率较高，可能与研究中心在武汉爆发中心有关。但其他两项研究中心也在武汉的却并未提及COVID-19患者有结膜炎及其他眼部感染症状，一项观察了41例患者[21]，另一项观察了138例患者[22]，均未指出有眼部感染症状。各项研究结果见表1。

表1 各项临床研究结果

当前临床研究结果并未对结膜是SARS-CoV-2的传播途径提供有力证据。但最新发表在预印本平台bioRxiv的动物研究结果显示，恒河猴结膜在接种SARS-CoV-2 1d后，即可转至呼吸道等组织，但未描述该恒河猴是否出现结膜炎症状。该研究证实了SARS-CoV-2可通过结膜传播至呼吸道，而且可能在未引发结膜炎的前提下即可传播至其他部位。在感染第7d的解剖结果显示SARS-CoV-2病毒载量的分布，主要集中在鼻泪管系统和眼内，包括泪腺、视神经和结膜，但肺中相对较少且局限[23]。这是否提示由结膜感染的COVID-19患者症状相对较轻，研究还需进一步完善。

4临床研究结果不一致的原因分析

4.1采样时间的滞后SARS-CoV-2检测手段主要是分子生物学方法，采用RT-PCR检测患者分泌物中SARS-CoV-2的遗传物质。但病毒及其遗传物质可能只存在于疾病的某个阶段，并不是整个SARS-CoV-2感染过程中都有SARS-CoV-2遗传物质存在[25]。所以正确的采样时间是获取RT-PCR正确结果的关键。在恒河猴实验中结膜拭子仅在其结膜感染后第1d得到阳性结果，此后检测均为阴性[23]。该研究结果提示我们眼表感染SARS-CoV-2后，其核酸物质可被检出的时间可能极为短暂。现有的研究中很难在疾病早期，尤其是未出现症状的时期采集样本，而采样时间的滞后性与结膜拭子阳性率较低有关。其中一项采样时间较早的研究，在患者发病第3d进行结膜拭子检测，结果为阳性[16]。SARS-CoV-2在呼吸道可被检测出的时间为96h左右[3]，而以上的研究结果提示我们人眼表可被检测出的时间可能明显早于96h。所以眼表采样的有效时机不仅出现较早且短暂，大多数患者在就诊时极有可能已经错过。特别是有结膜炎症状的患者，症状的出现滞后于感染的发生，此时患者眼表的病毒可能已经被自身免疫清除，样本中病毒载量已经不在检测范围内[26]。而迄今为止，研究中观察的均为确诊患者，取样时间基本在7d以上，结膜拭子检测的及时性难以保障，最终导致结果的差异。

4.2样本质量的不确定样本质量是决定病毒核酸检测的重要前提，而采集方法是保障样品质量的关键。SARS-CoV-2传染性极强，其检测样本采集和保存的要求极为严格。目前用于传染性泪液样本的采集方法有反射性或精神性泪液采集法，毛细管虹吸法，Schirmer试纸法及冲洗泪液法[27]。但现有研究的采样方式基本以结膜拭子来收集结膜分泌物和泪液。正常情况下结膜囊仅容纳3～7μL泪液，结膜分泌物也相对较少[28]。可见留存于结膜囊的样品含量小，采样过程中又极易蒸发，正常情况下难以达到泪液取样要求。而且采样时不能使用麻醉药物，患者配合度差，样品污染的风险较高。所以尽管有研究在无结膜炎患者的结膜拭子中检测出阳性结果[13,22]，但也难排除假阳性结果。加之RT-PCR检测敏感性较差，对样品质量要求较高，检测过程中遗传物质极易受到破坏而造成假阴性，需要多次测试以提高灵敏度，排除假阴性。目前临床研究多数仅进行1次检测，病例数较少，难以达到多个样本重复测试。Xia等[16]为提高准确性进行了两次结膜拭子检测，结果并未在不伴有结膜炎的COVID-19患者中得到阳性结果。但未在患者的结膜分泌物和泪液中分离和培养出活的SARS-CoV-2，所以该研究也不能排除假阳性和假阴性的干扰，样品也存在被气溶胶污染的可能。此外也未能明确合并结膜炎患者的阳性率高，是否与炎症刺激后结膜分泌物和泪液增多，使样本量采集足够有关。所以国外研究试图采用Schirmer试纸法增加泪液样本量以获取更为准确的结果[18]，但Schirmer试纸离心后获取的泪液量同样有限，也存在假阴性的可能。所以未来还需寻找更为安全有效的采样方法以确保研究结果的准确性。

4.3泪液中可能不存在病毒已知的人冠状病毒研究发现其不耐酸不耐碱，而且病毒复制的最适宜pH值为7.2[29]。人泪液略碱性(pH7.6)，对于冠状病毒来说可能并不是一个良好的培养基，病毒不能迅速自身繁殖[28]。SARS-CoV-2作为一种新型冠状病毒，泪液可能也并不适宜其生存，目前研究也并未在泪液中分离出活的SARS-CoV-2病毒株，所以泪液中可能并不存在具有生物学活性的SARS-CoV-2。加之结膜囊是一个开放的环境，它暴露在空气中，眼泪蒸发及其并不丰富的血液供应使其温度偏低，存留在结膜囊中的病毒通常可通过瞬目、泪液排泄等机械作用排出[28]。所以正常情况下病毒在结膜囊中停留的时间极为短暂，留存的病毒也可被机体快速清除。尽管环境PH值对SARS-CoV-2的蛋白酶活性的影响尚不明确，但研究已经发现ACE2需在酸性环境下催化活性最强[30]。加之人结膜上皮仅表达少量的ACE2，SARS-CoV-2与结膜的结合力较弱，相较于其他组织结膜上的SARS-CoV-2可能极易被清除，且在短时间内迅速传播至其他部位。所以在泪液样本中获取活的SARS-CoV-2病毒株可能较为困难。而目前研究也并未从确诊患者的泪液中分离出活的SARS-CoV-2病毒株。此外，研究中多数患者在取样前已经接受了抗病毒治疗，而采集眼部标本的最佳时机是在发病初期或使用抗病毒药物治疗前，抗病毒药物的使用或许加速了结膜组织中病毒的清除。新加坡的最新研究也使用了局部注射来改善眼部症状[18]，由于研究中未提及泪液取样时间和治疗时间，并不能明确其对结果的影响。所以目前的研究结果显示大多数患者结膜囊分泌物及泪液样本中均未检出SARS-CoV-2，尽管极少数患者检为阳性结果，但也不能说明泪液中有SARS-CoV-2，因为RT-PCR阳性结果并不提示有活的SARS-CoV-2，也可能是泪液中免疫球蛋白、溶菌酶等使SARS-CoV-2失活后裂解释放出的遗传物质。

5启示与展望

阻断感染的发生，是目前最积极有效的抗疫方式。已有的文章显示，结膜是SARS-CoV-2的可能感染途径之一，但研究并未在泪液中获取活的SARS-CoV-2病毒株。岂止目前，关于SARS-CoV-2通过结膜进一步感染呼吸道的机制尚不清楚。而且结膜炎对于COVID-19病情预后评估有何意义也未明确。此外，各项研究中对结膜炎的发生率描述差异较大为0～31.6%，但多数发生率较低，尤其是作为首发症状。根据已有研究，多数伴发结膜炎的患者，其结膜极有可能接触到含有高浓度SARS-CoV-2的气溶胶。而以结膜炎为首发症状的多数为医务人员在进行高危操作时未行眼部防护，3d左右即出现结膜炎症状。由此也进一步提醒我们，当处于密闭环境且长期暴露在含有气溶胶的空气中，一定要严格进行眼部防护。而日常生活产生气溶胶的可能性较小，所以主要以勤洗手，避免揉眼等触摸眼部的动作等来切断结膜感染途径。值得注意的是，人眼结膜在接触SARS-CoV-2后，或许并不引发结膜炎，却已经快速传播至其它部位，这一推测还需要进一步研究来证实。

经结膜感染与结膜炎的关系目前尚未清楚，关于SARS-CoV-2引发结膜炎的病毒量以及机制还需进一步研究。现有研究所涉及的检测手段是RT-PCR。但RT-PCR结果仅提示样品中有病毒的遗传物质存在，并不意味着一定存在具有感染性的活性病毒颗粒，更不能说明样本中病毒载量可造成人群间的传播。而且用于检测的样本，其采集、保存、转运，以及检测过程中核酸的提取、结果的判读要求极高，需由专业人员严格操作才能保障检测结果的正确性。还强调多次、多种标本和错综检测试剂盒进行检测和验证以提高检测阳性率[1]。受条件限制，现有的临床研究大部分仅检测一次，很难确保研究结果的准确性。加之患者在感染SARS-CoV-2到结膜炎症状的出现，存在明显“窗口期”，出现眼部症状后再进行检测可能已经错过有效检测时机。所以目前的研究结果均难排除假阴性和假阳性的干扰。未来研究应考虑更为稳定的研究手段，通过检测泪液和结膜囊分泌物中SARS-CoV-2的IgM与IgG抗体，或许能帮助我们更准确地认识结膜和泪液的传染风险。

综上，关于SARS-CoV-2的来源、感染后排毒时间、COVID-19发病机制等尚未明确。SARS-CoV-2已经引发全球疫情蔓延，严重威胁世界人民的生命健康。未来研究还需要进一步明确SARS-CoV-2经结膜感染随病程变化的改变，以便对结膜炎的发生、发展、转归有更全面的认识。全球疫情仍然严重，我国仍有许多境外输入和无症状患者，2020-03-06的疫情防护救治进展情况指出，在此次疫情发生的早期，湖北省有超过3000名医护人员被感染，主要与医生的防护不到位有关。在发现医务人员感染的情况后，立即加强了医务人员的防护工作，制定了预防感染的技术指南和防护规范，采取严格的管理措施，有效地控制了医院的院内感染，从统计情况看，到目前没有感染的报告[31]。这与意识到结膜是可能的感染途径后，重视眼部防护有一定的关系。所以尽管对于SARS-CoV-2仍存在诸多未知，但准确适当的防护仍是阻断SARS-CoV-2感染发生的有效措施。而经结膜感染与结膜炎发生的机制还需进一步研究，这样才能尽早为科学防控提供有力证据。

1靳英辉, 蔡林, 程真顺, 等. 新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的肺炎诊疗快速建议指南(标准版). 解放军医学杂志2020；45(1)：1-20