miR-221对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡的作用机制

路 璐, 李 欢

0引言

miRNA为短链的非编码内源性保守的微小RNA分子，其通过抑制靶基因的转录或翻译过程及调控信号通路的活性，在疾病的发生发展中具有重要作用[1]。miR-221在机体多种肿瘤中均出现表达失调，其在糖尿病引起的疾病中也有重要作用[2]，但是其在糖尿病视网膜病变中的功能及作用机制研究甚少。本研究拟以高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞HRCECs为研究对象，检测其中miR-221、p53、MDM2的表达，观察过表达miR-221、抑制miR-221、过表达MDM2对高糖诱导的HRCECs细胞凋亡的影响，揭示miR-221促进高糖诱导的HRCECs细胞凋亡的机制与P53/MDM2信号通路有关。

1材料和方法

1.1材料人视网膜血管内皮细胞HRCECs购自ATCC；DMEM培养基购自美国GIBCO公司；Trizol液购自上海恪敏生物科技有限公司；LipofectamineTM2000购自北京宜科思源科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京艾然生物科技有限公司；逆转录试剂盒购自大连TaKaRa公司；RIPA蛋白裂解液购自碧云天生物技术公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司。P53抗体购自上海研谨生物科技有限公司；MDM2抗体购自Abcam；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养将人视网膜血管内皮细胞HRCECs用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃,5% CO2的恒温培养箱中常规培养，每2～3d传代一次。

1.2.2细胞转染与分组将正常培养的HRCECs细胞分为NG组、HG组、HG+miR-NC组、HG+miR-221组、HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-221组、HG+miR-221+pcDNA 3.1组、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2组。各组细胞的处理方法分别为：NG组：用5mmol/L的葡萄糖处理48h的HRCECs细胞；HG组：用30mmol/L的葡萄糖处理48h的HRCECs细胞；将miR-NC、miR-221 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-221、miR-221 mimics+pcDNA 3.1、miR-221 mimics+pcDNA 3.1-MDM2按照脂质体LipofectamineTM2000试剂说明书的操作步骤转染至HRCECs细胞，转染5h后，弃去培养液更换新鲜的培养基继续培养48h，用qRT-PCR法确认转染效率达到要求。转染成功后用30mmol/L的葡萄糖处理培养48h，分别标记为HG+miR-NC组、HG+miR-221组、HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-221组、HG+miR-221+pcDNA 3.1组、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2组，用于后续实验研究。

1.2.3 qRT-PCR法检测细胞中miR-221、p53、MDM2的表达Trizol法提取对数生长期的细胞样本总RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度计进行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。逆转录反应采用逆转录试剂盒方式，操作按照试剂盒说明书进行，合成模板链cDNA。按照反应体系进行，反应结束后通过分析Ct值，以U6、β-actin为内参，计算定量结果，以2-△△Ct法测定miR-221、p53、MDM2的相对表达水平。引物信息(5’-3’)：miR-221上游引物ACACTCCAGCTGGGGAAACCCAGCAGACAA，下游引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGT；p53上游引物TGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGAC，下游引物CTGACGCACACCTATTGCAAGCAAGGGTTC；MDM2上游引物CACCTCACAGATTCCAGCTT，下游引物CGCCAAACAAATCTCCTAGA；β-actin上游引物GGACTTCGAGCAAGAGATGG，下游引物AGCACTGTGTTGGCGTACAG；U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.4 Western blot实验检测细胞中p53、MDM2的蛋白表达将对数期细胞进行冰上蛋白裂解1h，提取总蛋白，以BCA法测定样品蛋白的浓度。以4∶1的比例加入蛋白上样缓冲液，混匀，沸水浴变性5min，离心取上清，取60μg目的蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳。然后将蛋白湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h，TBST洗涤，4℃条件下，将封闭后的PVDF膜放入一抗(1∶1000稀释的P53抗体、MDM2抗体)中反应过夜，以封闭液洗膜3次，每次5min，再在37℃下将PVDF膜转入二抗(1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体)中反应2h。于暗室内ECL试剂盒显影曝光：滴加化学发光剂显影，以凝胶成像系统采集图像。Quantity One 4.62图像分析软件进行条带灰度分析，以GAPDH为内参，以目的条带灰度值与GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表达情况。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验检测细胞凋亡将1.2.2各转染组细胞，用500μL的Binding Buffer悬浮细胞，分别加入5μL的Annexin V-/FITC避光反应20min后再加入5μL的PI避光反应20min，用300目铜筛过滤，最后在1h内上流式细胞仪结束检测。细胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

2结果

2.1 miR-221在高糖诱导的HRCECs细胞中的表达结果如图1所示，与NG组相比，HG组细胞中miR-221表达显著升高，差异有统计学意义(t=32.863，P<0.05)。

图1 miR-221在高糖诱导的HRCECs细胞中的表达 aP<0.05 vs NG组。

2.2 p53和MDM2在高糖诱导的HRCECs细胞中的表达结果如图2所示，与NG组相比，HG组细胞中p53的mRNA和蛋白表达均显著升高(t=15.274、16.127，均P<0.05)，MDM2的mRNA和蛋白表达均显著降低(t=22.472、16.994，均P<0.05)，差异均有统计学意义。

图2 p53和MDM2在高糖诱导的HRCECs细胞中的表达 A：p53、MDM2在高糖诱导的HRCECs细胞的mRAN的表达；B：p53、MDM2在高糖诱导的HRCECs细胞的蛋白表达。aP<0.05 vs NG组。

2.3过表达miR-221对高糖诱导的HRCECs细胞凋亡的影响结果如图3所示，NG组、HG组、HG+miR-NC组、HG+miR-221组细胞凋亡率比较，差异具有统计学意义(F=29.506，P<0.01)。与NG组相比，HG组细胞的凋亡率显著升高(P<0.05)，与HG+miR-NC组相比，HG+miR-221组细胞的凋亡率显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图3 过表达miR-221对高糖诱导的HRCECs细胞凋亡的影响 aP<0.05 vs NG组，cP<0.05 vs HG+miR-NC组。

2.4抑制miR-221对高糖诱导的HRCECs细胞中p53、MDM2表达及凋亡的影响结果如图4所示，HG组、HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-221组细胞中p53 mRNA和蛋白表达、MDM2 mRNA和蛋白表达、凋亡率比较，差异均有统计学意义(F=707.353、211.787、372.761、334.887、170.664，均P<0.01)。与HG+anti-miR-NC组相比，HG+anti-miR-221组细胞中p53的mRNA和蛋白表达均显著降低，MDM2的mRNA和蛋白表达均显著升高，细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.5过表达MDM2对抑制miR-221的抗高糖诱导的HRCECs细胞凋亡的影响结果如图5所示，HG组、HG+miR-221+pcDNA 3.1组、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2组细胞凋亡率、p53蛋白表达、MDM2蛋白表达，差异均有统计学意义(F=202.442、347.115、621.257，均P<0.01)。与HG组相比，HG+miR-221+pcDNA 3.1组细胞凋亡率显著升高，p53蛋白表达显著升高，MDM2蛋白表达显著降低，HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2组细胞凋亡率显著降低，p53蛋白表达显著降低，MDM2蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与HG+miR-221+pcDNA 3.1组相比，HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2组细胞凋亡率显著降低，p53蛋白表达显著降低，MDM2蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。

图5 过表达MDM2对抑制miR-221的抗高糖诱导的HRCECs细胞凋亡的影响 A：过表达MDM2对抑制miR-221的抗高糖诱导的HRCECs细胞凋亡的影响；B：过表达MDM2对抑制miR-221的抗高糖诱导的HRCECs细胞中p53、MDM2蛋白表达的影响。aP<0.05 vs HG组,cP<0.05 vs HG+miR-221+pcDNA 3.1组。

3讨论

miRNA参与人类机体的多种疾病的发生发展，其中包括糖尿病[3-4]。由于miRNA的调控网络十分复杂，因此其在疾病中的作用机制成为研究的热点和难点。据报道，miR-221在糖尿病肾病、糖尿病心脏疾病中均出现异常表达[5-6]。Daniel等[7]报道，miR-221和miR-222在糖尿病小鼠血管平滑肌细胞中的表达上调，促进糖尿病小鼠的血管内膜增厚，而抑制上调的miR-221和miR-222可有效预防糖尿病心血管疾病，其可能与细胞外信号应答激酶-1/2(ERK-1/2)和p27Kip1有关。Liu等[8]在研究中报道，miR-221在糖尿病视网膜病变患者血清中的表达水平明显的上调，并与患者的总体存活率具有显著的相关性，更重要的是，miR-221的诊断效率明显的高于Ang Ⅱ、VEGF，揭示血清miR-221作为潜在的生物标志物不仅与T2DM患者DR的发生有关，而且与DR的进展有关。遗憾的是，没有继续进行miR-221在糖尿病视网膜病变的体外研究。本研究用高糖诱导了HRCECs建立糖尿病视网膜病变的体外研究细胞模型，检测了其中miR-221的表达水平发现，miR-221高表达，这与Liu等[8]在患者血清中的检测结果相呼应；进一步研究，通过流式细胞术检测过表达miR-221在高糖诱导的HRCECs细胞中的作用发现，过表达miR-221后，高糖诱导的HRCECs细胞的凋亡率上调更严重，并上调p53、下调MDM2， 抑制miR-221则起相反的作用抑制凋亡作用，这说明miR-221在高糖诱导的HRCECs凋亡中具有促进作用，提示miR-221具有促进糖尿病视网膜病变的恶性进展的作用，推测可能与p53/MDM2通路相关，为糖尿病视网膜病变的诊断和治疗提供新的靶点。

p53为一种可诱导细胞凋亡核磷酸蛋白，其在糖尿病大鼠的视网膜毛细血管内大量积累[9-10]。MDM2是一种负向调节p53的下游因子，其可通过与p53结合引起其泛素化降解，从而抑制p53引起的凋亡级联反应[11-13]。有研究报道，MDM2过度表达时，可抑制p53的功能[14]。郭承伟等[15]在研究中发现，在糖尿病视神经病变大鼠模型中，p53的表达明显升高，MDM2的表达明显降低，大黄虫丸治疗后，p53、MDM2的表达得到平衡，可见，p53/MDM2通路在糖尿病视神经病变中的关键作用。本研究检测了高糖诱导了HRCECs细胞中p53、MDM2的表达发现，p53的表达升高，MDM2的表达降低，二者呈明显的负相关，这与前人的实验结果均相一致；进一步研究发现，p53、MDM2的表达水平受miR-221的调控，这为p53/MDM2信号通路的调控机制研究提供参考依据；深入研究发现，过表达MDM2可逆转抑制miR-221的抗高糖诱导的HRCECs细胞凋亡，这说明不仅miR-221可调控p53/MDM2信号通路，相反，MDM2也可反向调控miR-221在高糖诱导的HRCECs细胞的功能。

综上所述，miR-221可促进高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡，其作用机制与调控p53/MDM2信号通路调控有关，为糖尿病视网膜病变的治疗提供新靶点。