‘镇研958 六号’辣椒杂交种纯度的SRAP 鉴定

卢国强 许 展 王 云 吉振勇*

（1.镇江市镇研种业有限公司， 江苏镇江 212005； 2.江苏大学食品与生物工程学院， 江苏镇江 212013）

1 前言

辣椒 (Capsicum annuumL.) 是我国重要的蔬菜作物，栽培区域广泛、适应性强，营养丰富，深受消费者喜爱。利用杂种优势选育抗病、高产、优质的杂交种，是辣椒品种选育过程中最常用的方法。但杂交育种的过程中，由于人工去雄不彻底或育性不彻底等原因导致母本自交产生假杂种；此外，在制种过程中由于隔离不严而导致其他混杂花粉掺入等影响杂交种纯度。传统的种子鉴定方法主要有种子形态鉴定法、幼苗鉴定法和田间小区种植鉴定法，这些方法不仅需要较多的土地、劳力与财力等限制因素，而且鉴定周期长，且易受经验限制及栽培措施和环境因素的影响，其准确性难以保证[1]。

随着DNA 分子标记技术的问世及迅速发展，使得从基因组水平上检测杂交种纯度成为可能。与传统的遗传标记相比，分子标记具有操作简单方便、多态性丰富、分析不受环境及基因是否表达影响和结果准确可靠等优点[2]。相关序列扩增多态性 （Sequence-related amplified polymorphism, SRAP）是由美国加州大学Li 和Quiros 于2001 年在研究芸薹属作物时开发出来的一种基于PCR 的分子标记技术[3]，其原理是利用基因外显子里G、C 含量丰富，而启动子和内含子里A、T 含量丰富的特点设计两套引物，对开放阅读框 （Open reading frames, ORFs） 进行扩增，因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。SRAP 标记具有简便、稳定、中等产率、在基因组中分布均匀的特 点[4-5]，因而在作物遗传连锁图谱构建[6]、重要性状基因标记定位与克隆[7-8]、种质资源遗传多样性与系统发育分析[9-10]及遗传纯度检测[11-12]等方面有着广泛应用。‘镇研958 六号’辣椒品种早熟、高产且表现出较好的抗病性，具有很高的推广应用前景。试验以‘镇研958 六号’F1代种及其亲本为材料，采用SRAP 标记技术对杂交一代种子进行检测，旨在为‘镇研958 六号’F1代纯度鉴定提供依据，进而为辣椒杂交种品种真实性分子标记鉴定和杂交种子纯度分子标记检测技术提供理论基础, 为新品种审定和推广提供技术支撑。

2 材料与方法

2.1 材料

‘镇研958 六号’及其父母本来自镇研种业有限公司的江苏徐州原种扩繁基地，于2020 年5 月品种正常成熟时取其植株叶片，提取DNA。

2.2 DNA 的提取

DNA 的提取采用CTAB 法[13]。辣椒叶片于液氮中研磨成粉后转移至50 mL 离心管中，加入DNA 提取缓冲液 （1% CTAB、0.7 M NaCl、10 mM EDTA、20 mM β-巯基乙醇），将离心管置于65 ℃振荡水浴90 min，冷却后加入等体积氯仿/异戊醇（24 ∶1） 溶液，混匀，8 000 r/min 离心10 min。将上清液转移至另一灭菌离心管中，加入等体积异丙醇， 混匀，8 000 r/min 离心10 min，去上清， 沉淀用70%乙醇洗涤2 次，双蒸水溶解。DNA 经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测、紫外分光光度计测定浓度和纯度后，于4 ℃下保存备用或于-20 ℃下长期保存。

2.3 SRAP 扩增与检测

引物设计参照Li 等[3]发表的引物序列，选用上游引物5 条、下游引物6 条，配对组合共30 对引物进行筛选（表1）。PCR 采用20 µL 体系，包含40 ～ 50 ng 模板DNA，3.0 mmol/L MgCl22 µL，1 mmol/L dNTPs 4 µL，1 µmol/L 引物 5 µL，1 U /µL Taq 酶 1 µL，用灭菌蒸馏水补齐至20 µL。SRAP 扩增程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性1 min，35 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1.5 min，5 个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，33 个循环，72 ℃延伸7 min。不同引物对PCR 反应退火温度见表2。PCR 产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色。

表1 SRAP 引物与序列

表2 不同引物PCR 反应中所用退火温度

3 结果与分析

3.1 辣椒叶片基因组DNA 的提取与检测

Nanodrop 超微量分光光度计分析表明，提取辣椒叶片基因组DNA 的A260nm/A280nm的比值在1.8 ～2.0 之间，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测显示无明显DNA 降解（图1）。上述分析结果表明提取的DNA 质量良好，满足分子标记检测的要求。

3.2 特征引物筛选

本研究利用30 对SRAP 引物分别对受试辣椒品种进行多态性筛选，其中E3M1 引物在‘镇研958 六号’杂种一代及其父母本中能扩增出稳定、清晰的多态性条带，扩增结果见图2。E3M1 引物扩增片段的多态性属于双亲互补型，用此方法检测F1代，不但可以鉴定出F1代种子中母本的占有率，而且可以检测出F1代种子中可能存在的掺假状 况[14]。因此，本研究选取E3M1 引物用于‘镇研958 六号’的种子纯度鉴定。

3.3 杂种纯度的鉴定

随机选取49 株‘ 镇研958 六号’辣椒植株的叶片样品，提取DNA，以E3M1 为引物，分别进行SRAP 扩增，结果发现，第44 株出现母本特征谱带，其余48 株出现F1代特征谱带，纯度为98%，假杂种为母本自交种子，与成株期形态鉴定结果相吻合。进一步的田间植株表型鉴定，在随机选取的120 株‘镇研958 六号’群体中，观察到4 株表型表现与亲本一致，田间种子纯度鉴定为96.7%，与分子标记鉴定结果基本一致。

4 讨论

目前辣椒杂交种纯度主要的鉴定方法有田间形态学鉴定法和生化检测法等。形态学鉴定法易受环境条件的限制，费时费力，鉴定的准确性也受观察者经验的制约；生化检测技术操作过程复杂，费事费钱，都不能满足种子纯度鉴定和育种工作发展的需要。SRAP 分子标记是直接以基因组DNA 为模板扩增的产物，具有准确、快速、不受基因表达和环境因素影响，且不受器官、组织及发育特异性等限制等优点。此外，由于上游引物与下游引物可自由组配，因此用少数的引物可进行多种组合，大大减少了合成引物的费用，同时也提高了引物的利用率。

本研究利用SRAP 标记筛选出能在‘镇研958 六号’F1代及其父母本间扩增出稳定多态性的E3M1 引物，SRAP 分子标记种子纯度鉴定结果与大田形态鉴定结果基本一致，这表明利用SRAP 标记建立的快速种子纯度检测体系鉴定辣椒种子纯度是可行的，从而有望克服田间调查周期长、受环境因素干扰较大等问题。