环形RNA在肿瘤增殖与转移中的作用

侯艳艳， 范基农， 刘湘帆， 倪培华

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验系，上海 200025；2.上海市临床检验中心，上海 200126）

环形RNA（circular RNA，circRNA）是一种新型的非编码RNA，是由前体RNA的5'端和3'端共价闭合形成的环状结构，其多数定位于细胞质，且序列高度保守，不易被核酸酶降解，在体内非常稳定，并具有组织或发育阶段特异性。高度丰富并进化保守的circRNA已被发现在心血管疾病、神经系统疾病、感染和癌症中发挥重要作用。我们主要讨论circRNA在肿瘤发生与发展中的作用，包括肿瘤的增殖和转移，并进一步展望circRNA对肿瘤的筛查、诊断、预后评估以及靶向治疗的可能性。

1 circRNA的形成、生物特征、作用机制与检测方法

circRNA在真核细胞中分布广泛，且具有许多显著特性和重要生物学功能，因此成为非编码RNA领域的研究热点。

circRNA根据不同的组成和循环机制可以分为4类：外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA和tRNA内含子所形成的circRNA。目前存在3种假设模型来解释外显子circRNA的形成[1]。（1）套索驱动的环化，指由外显子组成的剪接供体和剪接受体共价结合；（2）内含子配对驱动的环化，由2个内含子互补配对结合从而形成环化结构；（3）RNA结合蛋白诱导的环化，由前体RNA的内含子两侧的RNA结合蛋白相互作用形成环状结构，发生末端连接，形成circRNA。

circRNA是一类具有显著特征的RNA分子。（1）高丰度，circRNA广泛表达于各种物种中，在人类细胞中circRNA占所有转录本的10%以上[2]；（2）稳定性，无5'帽子和3'poly A尾的结构特征使环状RNA具有对核糖核酸酶的消化抗性，大多数环形RNA的半衰期超过48 h，而其线性对应物的半衰期＜20 h[3]；（3）保守性，circRNA的保守性主要表现为哺乳动物之间circRNA的共同表达，例如，大约15 000个circRNA在人类和小鼠的同源基因座中均有表达，分别占人类和小鼠circRNA总量的15%和40%[4]；（4）特异性，circRNA通常以细胞特异性和组织特异性方式表达，例如由外显子组成的circRNA通常位于细胞质中[5]；（5）在人类和小鼠中，circRNA倾向于在大脑和血小板中富集[6]。

目前研究认为，circRNA具有强大的生物学功能。（1）通过“海绵作用”吸附微小RNA（microRNA，miRNA）。circRNA上存在miRNA结合位点，可以结合特定的miRNA，调节miRNA和mRNA的结合，发挥竞争性内源RNA的功能。高水平的circ_0020710可以通过结合miR-370-3p来上调趋化因子CXC配体12（CXC-motif-chemokine 12，CXCL12）表达。CXCL12的下调可逆转由circ_0020710表达引起的黑色素瘤细胞的恶性行为[5]。（2）吸附RNA结合蛋白（RNA-binding protein，RBP）。在细胞质中表达的circRNA能与蛋白质结合，进而抑制蛋白质向细胞核的运输。circZKSCAN1可充当RBP海绵，与脆性X智力低下蛋白（fragile X mental retardation protein，FMRP）靶基因CCAR1竞争，随后使Wnt/β-catenin信号通路失活从而抑制肿瘤行为[7]。（3）编码蛋白质和多肽。circ-MALAT1在临床肝细胞癌样本的癌症干细胞中高表达，circMALAT1通过与核糖体和mRNA形成三元复合物，阻止PAX5 mRNA的翻译并促进癌症干细胞的自我更新[8]。（4）调节基因转录和选择性剪切。circRNA可通过与RNA聚合酶Ⅱ以及其他转录因子相互作用来调节亲本基因的表达。

目前用于检测circRNA的方法有很多种，各个检测方法都有一定的优点与局限性，见表1。

表1 常用检测circRNA的方法

2 circRNA在肿瘤生长和转移过程中的作用

circRNA在肿瘤细胞的增殖和转移过程中发挥着重要作用，在细胞周期、上皮间质转化，以及增殖与转移相关信号通路中circRNA作用均有最新成果。

2.1 circRNA对细胞周期相关蛋白/激酶的调控

细胞周期的进展是高度有序、逐步发生的，主要受cyclin细胞周期素、细胞周期素依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）以及细胞周期素依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）的控制。因此，细胞周期各阶段推进的核心机制是cyclin、CDK、CKI之间合成组装、修饰活化、拆卸降解和转换的过程。

circRNA参与调节周期蛋白或激酶的表达，被认为是细胞周期的基本参与者。ZHENG等[14]发现，来源于NR3C1的circRNA（circNR3C1）在膀胱癌组织和细胞系中表达量显著下调，circNR3C1直接作用于miR-27a-3p可阻止其与cyclinD1 mRNA 5'UTR的相互作用，并随后通过抑制cyclin D1蛋白的表达来抑制细胞周期进程。同样，在肝癌细胞中has-circ-0000204可以通过“海绵作用”吸附miR-191，miR-191的上调抑制了Kruppel样因子6（Krüppel-like factor 6，KLF6） mRNA和蛋白表达，从而促进了G1-S/G2-M期的过渡[15]，KLF6属于锌指转录因子家族成员，其靶标蛋白有P21、cyclin D、c-MYC等，在细胞增殖和细胞周期中扮演着非常重要的角色。circ-ZKSCAN1是使用circRNA微阵列技术在膀胱癌中筛选出表达显著下降的circRNA，circ-ZKSCAN1可以充当miR-1178-3p海绵，通过削弱miR-1178-3p使靶标蛋白P21的mRNA和蛋白表达上调，进而其抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭[16]。与此类似，BCRC-3在膀胱癌组织中表达降低，通过RNA下拉实验确认miR-182-5p是其唯一结合的miRNA，P27是miRNA结合的靶基因，因此circ-BCRC-3可以直接结合膀胱癌细胞中的miR-182-5p，从而促进下游效应子p27的表达[17]。DU等[18]的研究发现，circ-Foxo3的表达抑制了细胞增殖和细胞周期进程，circ-Foxo3在细胞内可以与P21、CDK2形成circ-Foxo3/p21/CDK2三元复合物，这个复合物的形成，不但使p21阻止了CDK2作用于cyclin E，避免了cyclin E/CDK2复合物的形成，从而阻断了G1期向S期的过渡，同时其还能消除p21对cyclin A/CDK2复合物的抑制作用，从而阻断S期细胞周期的进展。同样，circ-Ccnb1可以与cyclin B1和CDK1结合，从而解除cyclin B1/CDK1复合物的形成和核转移，使Ccnb1和CDK1不能发挥有丝分裂活性，抑制了肿瘤的生长并延长了小鼠的生存能力[19]。

2.2 CircRNA与上皮间充质转化相关蛋白

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是细胞侵袭和转移的关键驱动因素，其中上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadhefin，E-cad）的表达下降是EMT的重要标志。Snail、Twist、Slug和ZEB等EMT相关的转录因子可以与E-cad的E-box结合调节EMT。

Snail是转录阻遏物，它与E-box序列的调节区和启动子结合，调节许多不同基因的表达，并以此方式调节EMT。在膀胱尿道上皮癌中，circPRMT5的表达上调且circPRMT5会吸附miR-30c，通过circPRMT5/miR-30c/Snail1/E-cadherin途径促进尿道上皮癌细胞的EMT[20]。同样，在宫颈癌细胞中发现circRNA_000284上调，miR-506已被鉴定为circRNA-000284相关miRNA，Snail-2是miR-506的直接靶标，因此，circRNA-000284可以间接增加Snail-2的表达并促进侵袭和转移[21]。ZEB由ZEB1和ZEB2组成，与Snail基因家族成员相似，ZEB家族成员通过其2个锌指结构域与E-cadherin基因启动子中的E-box结合并触发EMT。例如CircNUP214在甲状腺乳头状癌细胞中发挥致癌作用，CircNUP214充当miR-145的海绵，而ZEB2是miR-145的功能靶标，CircNUP214/miR-145/ZEB2轴在甲状腺乳头状癌的发病机制中起关键作用[22]。Twist是一种重要的EMT，可直接或间接控制EMT相关基因的转录。有研究结果表明，Twist1通过与泛素化连接酶2（Cullin 2，Cul2）启动子结合来促进Cul2转录并上调Cul2的circRNA（circ-10720）表达，但抑制Cul2表达，circ-10720与Twist1正相关，并促进了EMT进展，因此circ-10720通过吸附miR-490-5p来上调波形蛋白的表达[23]。KLF属于含锌指的转录因子家族，可调节细胞增殖、分化和凋亡。ciRS-7在食管鳞状细胞癌中过表达，并可通过调节miR-7/KLF4轴和激活核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）-p65信号来触发食管鳞状细胞癌的迁移和侵袭[24]。

除了以上circRNA在转录因子的调控作用外，某些circRNA还通过直接或间接调节细胞黏附分子和细胞骨架蛋白的表达来发挥作用。例如：波形蛋白[25]、原钙黏蛋白α[26]、神经性钙黏素[27]等，此类失调的circRNA可以充当肿瘤抑制因子或致癌基因，以控制细胞增殖、侵袭和转移。我们总结了近年来circRNA在肿瘤增殖和转移中的作用，见表2。

2.3 circRNA与生长和转移相关信号通路

circRNA除了对上述蛋白分子进行调控之外，还对肿瘤增殖和转移的相关通路发挥着重要作用。SU等[28]的研究发现，circRIP2可吸附miR-1305，升高膀胱癌中的TGF-β2，并通过TGF-β2/Smad3途径诱导EMT，在膀胱癌中阻断TGF-β2会使circRIP2诱导的癌症进展和EMT丧失。CircMYO10通过吸附miR-370-3p上调RUVBL1促进染色质重塑而促进骨肉瘤进展，RUVBL1与β-catenin/LEF1复合物的结合增强β-catenin/LEF1复合物的转录活性[29]。在神经胶质瘤中，circNFIX通过靶向miR-34a-5p调控Notch1和Notch信号通路[30]。ZHANG等[31]的研究发现，在胃癌中有较高的circNRIP1表达，circNRIP1的下游是miR-149-5p，通过circNRIP1-miR-149-5p-Akt1/mTOR轴负责胃癌细胞中新陈代谢的改变，Akt/mTOR途径是介导肿瘤代谢稳态的经典信号途径之一，对肿瘤的生长和转移有益。circRNA-000911在乳腺癌细胞中起抗癌作用，miR-449a是circRNA-000911潜在的miRNA，circRNA-000911通过使miR-449a海绵化而正向调节Notch1表达，有学者鉴定出NF-κB信号通路是circRNA-000911/miR-449a途径的功能靶标[32]。见表2。

表2 circRNA在肿瘤增殖和转移中的作用

3 总结和展望

circRNA的发现丰富了人们对肿瘤生物学的认知，加深了对RNA更全面的理解，使其成为肿瘤生长和转移研究领域的热点，也为检验诊断开拓了新方向。常规检验已经被证明是很有前途的，但是开发临床验证的肿瘤检测生物标志物仍是一个挑战。近年来，circRNA在肿瘤增殖和转移方面是非常有潜力的肿瘤标志物。例如，血清circSETDB1在高级浆液性卵巢癌中上调，较高水平的circSETDB1与浆液性卵巢癌患者的临床分期、淋巴结转移呈正相关；原发化学耐药患者的血清circSETDB1水平显着增加，circSETDB1水平较高的患者的无进展生存期较短，因此血清circSETDB1可以作为一种新型的非侵入性生物标志物[33]。circMUC16在上皮性卵巢癌患者血清中的表达增加，其表达与肿瘤的分级和分期有关，因此，circMUC16可以作为上皮性卵巢癌的潜在生物标志物[34]。exo-hsa_circRNA_0056616的表达与肺腺癌的T期、M期和TNM分级之间存在显著负相关，因此，exo-hsa_circRNA_0056616是有价值的淋巴结转移性肺腺癌的诊断学生物标志物[35]。在多发性骨髓瘤患者中，hsa_circRNA_101237的表达升高，hsa_circRNA_101237可以用作多发性骨髓瘤新的诊断和预后生物标志物以及潜在的治疗靶标[36]。总之，circRNA在生物标志物的开发中显示出巨大的潜力，与线性RNA相比，具有环状结构的circRNA更稳定并且具有较长的半衰期，因此更适用于生物标志物的开发。虽然circRNA在检验诊断方面的应用还处于初级阶段，但是对大量临床样本的研究展现了其良好的临床应用价值，未来需要挖掘更多更有意义的circRNA，进一步评估其在临床检验工作的实际作用。相信随着新一代RNA测序技术的发展以及对更多临床样本的研究，circRNA会成为检验诊断和临床治疗的新模型。