间接法建立总胆红素和直接胆红素参考区间的探讨

吴 群， 沈隽霏， 吴文浩， 王蓓丽， 潘柏申， 郭 玮

（复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032）

临床实验室为了给临床提供可靠的判断标准需要建立一个准确、可靠的生物参考区间[1]。目前国际上认可的参考区间建立金标准为2010年由国际临床化学和检验医学联合会（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）及美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）共同修订的《临床实验室如何确定和建立生物参考区间；批准指南——第3版》（EP28-A3c导则），导则中提出通过建立排除标准，选取合适的参考样本来获得参考值（直接法）是建立参考区间的首选方法[2]。然而，直接法的建立需要消耗大量费用和时间，操作又较为繁琐，不利于推广和临床运用，因此现今大部分临床实验室直接引用厂商提供的参考区间，未考虑人群、地域等流行病学差异，这可能会导致参考区间不适用，从而给临床诊疗带来困扰[3]。因此，通过一个更为简便且科学的方法来获得参考区间成为临床实验室关注的焦点。目前，有众多学者提议利用实验室既有数据来建立以数学统计模式为基础的参考区间（间接法）[4-6]。为此，本研究利用复旦大学附属中山医院生物信息数据库中储存的胆红素检测数据及前期研究确立的间接法来建立胆红素的参考区间，并与直接法进行比较，验证运用间接法建立参考区间的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集复旦大学附属中山医院实验室信息系统中储存的2017年1—12月体检中心体检健康者的胆红素检测数据，项目包括总胆红素（total bilirubin，TB）和直接胆红素（direct bilirubin，DBil）。剔除信息不全的数据，通过比对实验室信息系统中储存的患者卡号筛选同一来源数据并选取时间最早的检测结果。

1.2 仪器和试剂

采用矾酸盐法检测TB和DBil，试剂和校准品均购自日本Wako公司，检测仪器为Cobas c 702全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司）。采用3水平常规生化多项目质控品（美国Bio-Rad公司，2017年批号分别为45721、45722、45723）及Westgard多规则（13s和22s）进行室内质量控制。

1.3 方法

采用间接法[7-8]建立TB和DBil的参考区间。

1.3.1 数据信息 健康体检人群的TB和DBil检测数据信息见表1。

表1 健康体检人群TB和DBil检测数据信息

1.3.2 数据正态性检验及转换 采用偏度-峰度检验[9]对数据进行正态性分析。非正态分布数据通过BOX-COX变换[10]转变为近似正态分布，并对变换后的数据使用偏度-峰度检验分析正态性。

1.3.3 离群值剔除 采用四分位间距法[11]剔除离群值。

1.3.4 数据分析 将收集的数据根据性别进行分组，采用非参数秩和检验分析是否存在性别差异，如有差异则分组建立参考区间。

1.3.5 参考区间的建立和验证 对剔除离群值后的数据使用Hoffman法[4]计算5%或95%位点的数值，最后再转化为最初的表达形式，得到最终的参考区间。计算各项目参考区间上、下限值与直接法建立的参考区间（我国行业标准）的相对偏差（两者的参考下限之间及参考上限之间差异的百分比）[12]，并与参考变化值（reference change value，RCV）进行比较，RCV的计算公式为：RCV=21/2×Z×（CVa2×CVi2）1/2，式中CVa为分析变异系数，CVi为个体内胆红素的生物学变异系数[13]，Z为差异的可能性概率值，取1.96（95%的可能性概率）[14]。相对偏差≤RCV认为二者之间无明显差异，高于RCV认为二者存在差异。

1.4 统计学方法

采用Excel 2016软件进行数据排序，计算RCV和参考区间的差异百分比。采用Minitab17软件进行统计分析。

2 结果

2.1 数据的正态性检验及转换

偏度-峰度检验结果显示，TB和DBil数据均呈非正态分布。采用BOX-COX对数据进行正态性转换，转换后各组数据均呈近似正态分布。见表2。

2.2 离群值剔除

使用四分位间距法剔除大于第75百分位数（P75）+1.5倍四分位间距（inter-quartile range，IQR）和小于第25百分位数（P25）-1.5倍IQR的数据。TB数据中，男性剔除784例，女性剔除578例；DBil数据中，男性剔除925例，女性675例。见表3。

表2 各组数据正态性检验和BOX-COX变换前、后结果

表3 离群值剔除前、后的数据对比

2.3 不同性别之间TB、DBil的差异

TB和DBil男、女性之间差异均有统计学意义（P=0.000），因此需按性别建立不同的参考区间。见表4。

表4 男性、女性TB、DBil检测结果比较μmol/L，中位数（范围）

2.4 参考区间的建立和验证

采用Hoffmann法获得男性、女性参考区间，TB男性、女性及DBil男性参考区间与直接法参考区间的相对偏差均低于RCV，提示建立的男性、女性TB参考区间及男性DBil参考区间与直接法参考区间无差异；DBil女性参考区间与直接法参考区间的相对偏差高于RCV，提示建立的女性DBil参考区间与直接法参考区间有差异。见表5。

表5 本研究建立的参考区间与直接法参考区间的比较

3 讨论

随着数字化和信息化时代的到来，“大数据”在医学领域也开始发挥作用，数据本身并不能产生价值，但是如何分析和利用大数据来为医学领域的工作作出贡献才是关键。而利用间接法来建立临床实验室生物参考区间则是大数据带给我们的礼物之一[15]。

众所周知，运用直接法建立参考区间虽然是金标准，但可行性较低，难以推广。因此大部分临床实验室直接沿用试剂厂商提供的参考区间，忽略了人群、地域等生物学差异，难以为临床提供适宜且可靠的参考区间。因此，以既有数据为基础，用数学统计方法来建立参考区间的间接法受到了广泛关注。EP28-A3c导则中也指出了直接法的局限性，并且允许实验室转化、验证或自行建立适合自己实验室的参考区间[4]。复旦大学附属中山医院已通过医院数据库的数据验证并建立了一些项目的参考区间，为后续的研究者提供了参考。

胆红素在评估肝胆疾病及溶血性疾病方面具有重要意义，因此准确建立参考区间非常重要。目前，国内已有若干研究利用直接法建立了各地区的胆红素参考区间[16-17]，但是尚未有文献报道使用间接法验证或建立胆红素的参考区间。为此，本研究旨在利用前期研究中的数据使用间接法来进行胆红素参考区间的建立和验证。

本研究使用了2017年体检者的胆红素数据，采用间接法建立TB和DBil的参考区间。结果显示，TB和DBil数据均呈非正态分布，使用BOX-COX法将数据转换为近似正态分布，随后采用四分位间距法剔除离群值。另外，由于TB和DBil男性、女性之间差异均有统计学意义（P=0.000），因此需按性别建立不同的参考区间。我国卫生行业标准WS/T 404.4—2018中TB的参考区间分为男性和女性2个组，而DBil未按性别分组，因此本研究中可能是由于样本量不足等原因，导致得出男女需分组的结论。由于胆红素为单侧参考区间，因此本研究采用第95百分位数作为参考区间上限，计算自建的参考区间与我国行业标准参考区间的偏差，将偏差与RCV比较。TB男性、女性与直接法参考区间的相对偏差均低于RCV，提示建立的男性、女性TB参考区间与直接法参考区间无差异，进一步证明了利用间接法建立参考区间的可行性。DBil男性参考区间与直接法参考区间的相对偏差均低于RCV，而女性则略大于RCV，原因可能是：（1）DBil检测结果较低，因此其变异系数（coefficient of variation，CV）相对较大，且检测结果越低，CV越大，导致差异略大于RCV；（2）采集的数据并不能够完全代替整个人群，始终存在人群和地域等生物学差异；（3）数据量不足。

采用间接法建立参考区间已经得到众多学者的认可和验证。本研究采用间接法建立了TB和DBil的参考区间，证明了采用四分位间距法联合Hoffman法建立参考区间的可行性。但间接法尚无统一的导则和标准，无法确定间接法所用的统计方法是否准确可靠，并且采集的数据也并不能完全代表目标人群，数据统计方面也存在个体差异等。同时，由于各实验室数据库数据量不一，又无相关指南规定数据量的标准，因此可能会出现差异。目前，已有多篇文献利用直接法建立了自己地区的胆红素参考区间，也普遍认为各地区胆红素差异较大，需要建立自己地区的参考区间[16-18]。尽管目前有着诸多限制，间接法仍可依靠其相对简便、科学的优势，为建立符合临床实验室要求的参考区间提供一条新的思路。

综上所述，本研究采用间接法建立的TB男性、女性和DBil男性参考区间与直接法参考区间无差异，证明采用间接法建立参考区间的可行性。而DBil女性参考区间与直接法参考区间的偏差虽稍大于RCV，但可以通过采集更多数据量并选取与直接法参考区间建立人群相似的人群数据等方法来减小这种差异。