远志薄层色谱鉴别及生物自显影色谱筛选研究*

刘雅晴，魏 巍，段 琦，袁 宇，王海波

（辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600）

远志作为临床常用药，来源为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志P.sibirica L.的干燥根，具有安神益智，交通心肾，祛痰，消肿等功效[1]。临床用于治疗心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸、咳痰不爽等，含有三萜皂苷、寡糖酯以及酮等类型成分[2]。市售远志饮片以栽培品种为主，因产地不同、生长年限差异等原因，质量参差不齐。市场流通时多根据外观性状进行分级销售，难以准确评价药效作用情况。远志药材成分复杂，对分离条件要求较高，在前期研究中[3]，采用高效液相色谱分离技术，实现了远志中含量较高、活性研究较深入的多种活性成分或质量标志成分含量的共同测定，但远志的薄层色谱鉴别研究还不够深入。2015年版药典对远志酮Ⅲ和细叶远志皂苷两个指标成分分别进行薄层色谱鉴别，操作过程繁琐，并未实现多种成分的同时鉴别评价。进行远志多成分薄层色谱研究，提高远志薄层色谱鉴别易用性，有助于加强远志药材质量评价管理。

乙酰胆碱酯酶抑制剂是目前治疗阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）效果较好的一类药物[4，5]，远志成分在AD等神经系统疾病治疗方面具有较多的应用，采用薄层色谱生物自显影法，筛选远志抗乙酰胆碱酯酶（AChE）活性成分，可以寻找其中具有治疗AD作用的先导化合物，有助于发现其药效物质成分。

本课题利用薄层色谱法[6-8]对远志药材进行定性分析，找出远志药材薄层色谱鉴别特征及质量评价指标，为远志的等级划分及质量标准提高提供研究支持。通过薄层色谱生物自显影技术分析筛选出远志药材中抑制AChE酶活性成分[9]，筛选天然AChE酶抑制剂，为远志活性成分开发提供支持。

1 仪器与材料

2F-2C型暗箱式自动紫外分析仪（上海市安亭电子仪器厂）；B-260恒温水浴锅，移液枪（上海苏阳仪器有限公司）；KQ5200DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Linomat5半自动点样仪（瑞士卡玛公司）；Visualizer自动薄层色谱分析仪（瑞士卡玛公司）；CP225D十万分之一天平（SARTORIUS）；ACCULABALC-110.4 万 分 之 一 天 平（SARTORIUS）。

硅胶G（中国青岛海洋化工）；甲醇（色谱纯 天津大茂化学试剂厂）；乙腈（色谱纯天津市大茂化学试剂厂）；H3PO4（AR国药集团化学试剂有限公司）;纯净水（辽东半岛饮用纯净水有限公司）;远志皂苷元（批号：150122）、3,6′-二芥子酰基蔗糖（批号：CHB150706）、细叶远志皂苷（批号：141027）购于成都克洛玛生物科技有限公司；远志糖苷A（批号：160125）、远志酸（批号：141127）、远志皂苷 B（批号：150629）、远志酮Ⅲ（批号：150605）、远志糖苷 C（批号：160125）、西伯利亚远志糖 A6（批号：16081504）均购于成都曼思特生物科技有限公司，经检验纯度均超过98.5%。远志药材购置于药材公司或药店，经鉴别为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.的干燥根，来源见表1。瓜子金药材采于广西北流市六麻镇，经鉴别为远志科植物瓜子金P.japonica Houtt.的干燥全草。

表1 远志药材产地信息表Tab.1 Polygala origin information sheet

2 方法与结果

2.1 远志药材的TLC鉴别

2.1.1 薄层色谱条件 硅胶G薄层板，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10，下层溶液，冷冻分层）为展开剂，预饱和30min，在室温条件下展开，展距为 12～14cm。

2.1.2 混合对照品溶液制备 分别精密称定远志糖苷A、远志皂苷元、3,6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷、远志酮Ⅲ对照品适量，加甲醇制成每1mL含量分别是 0.6、0.6、0.4、1、0.2mg 的混合对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称取不同产地的远志药材样品1g，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇25mL溶解，超声30min，过滤，超声提取两次，合并两次滤液，滤液用水浴锅蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，4000r·min-1离心3min，上清液作为供试品溶液，备用。

2.1.4 TLC分析 精密吸取各供试品溶液及混合对照品溶液，条带状点样2μL。展开后，置紫外灯365nm下进行检视，再均匀喷以5%香草醛浓硫酸显色剂，105℃加热至斑点显色清晰，色谱图结果见图1。

图1 远志TLC结果图Fig.1 Results of P.Radix TLC

结果表明，依据混合对照品可以看出，365nm下检视，远志酮Ⅲ在Rf值0.23处显黄色斑点，3,6'-二芥子酰基蔗糖在Rf值0.36处显蓝色斑点，远志糖苷A在Rf值0.45处显蓝色斑点。5%香草醛浓硫酸显色后检视，细叶远志皂苷在Rf值0.14处显紫色斑点，远志皂苷元在Rf值0.6处显紫色斑点。

在12批远志供试品色谱中，Rf0.23黄色斑点（远志酮Ⅲ）、Rf0.36蓝色斑点（3,6'-二芥子酰基蔗糖）、Rf0.45蓝色斑点（远志糖苷A）与对照品色谱相对应；但不同样品色谱斑点略有差异。5%香草醛浓硫酸显色后，6 份远志样品（S1、S2、S7、S9、S12、S15）供试品色谱中，Rf0.14紫色斑点（细叶远志皂苷）与对照品相对应，其它样品则未检出；Rf0.6紫色斑点（远志皂苷元）均未检出。

由薄层鉴别结果可知，在远志供试品溶液色谱中，365nm下可见12个清晰色谱斑点。本研究实现远志药材中的远志酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、远志糖苷A、细叶远志皂苷、远志皂苷元五种成分的良好分离和鉴别。其中，远志酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、远志糖苷A 3个成分能够实现远志药材的特征鉴别；细叶远志皂苷、远志皂苷元色谱斑点清晰程度，可用于评价远志皂苷类活性成分质量优劣。

2.2 抑制AChE酶作用自显影色谱研究

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取远志糖苷A、远志糖苷C、远志皂苷元、西伯利亚远志糖A6、远志汕酮Ⅲ、瓜子金皂苷己对照品适量，加甲醇或乙腈-水（7∶3）溶解，制成每 1mL 含量分别是 2、5、5、1、0.5、5mg的对照品溶液，备用。

精密称取远志皂苷B、3,6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷、远志酸适量，加甲醇制成每1mL含量分别是 0.5、1、0.2、1mg的混合对照品溶液，备用，作为对照品溶液Ⅱ。

2.2.2 薄层自显影分析 取远志样品溶液、各对照品溶液、混合对照品溶液Ⅱ、瓜子金样品溶液，按2.1.4项下方法点样，展开后，将薄层板取出，晾干。再用PBS（PH8.0）将薄层板喷湿，再均匀喷上AChE（1U·mL-1）和乙酸 β 萘酚（2.5mg·mL-1）。在 37℃湿润环境下孵育20min后，均匀喷上固蓝B试剂（0.5mg·mL-1），显色 5min。分析结果见图 2。

自显影色谱薄层板上，有抑制AChE酶活性化合物存在的部分呈现白色斑点，其他部分为紫色背景。结果表明,远志糖苷C在Rf值0.49处显白色斑点，远志药材在Rf值0.05处显白色斑点，瓜子金药材在Rf值0.07处显白色斑点，其余对照品均未显现出白色斑点。故远志糖苷C、远志药材、瓜子金药材对乙酰胆碱酯酶有抑制作用。本方法成功筛选出远志药材中1个活性成分，实现对远志药材抑制乙酰胆碱酯酶作用的研究，为远志资源开发乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物提供支持依据。

2.3 薄层色谱鉴别条件筛选

选择分别进行不同展开剂的分离效果筛选，进行不同组成的三氯甲烷-甲醇-水、三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水-磷酸筛选。结果显示，实验所用展开剂分离度更高，分离效果好，能够实现远志不同成分的分离和鉴别。薄层色谱分离实验中，我们发现展开温度对远志药材成分分离效果影响很大。显色剂选择考察了多种显色剂，60%硫酸乙醇，10%硫酸乙醇，5%香草醛浓硫酸。结果发现，5%香草醛浓硫酸显色效果较好，色谱斑点清晰。

3 结论

（1）本研究利用薄层色谱法对远志药材进行薄层定性分析，色谱图斑点较为清晰，分离度高，鉴别效果好。本实验通过对12种不同产地远志药材进行分离鉴别，实现远志药材中的远志酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、远志糖苷A、细叶远志皂苷、远志皂苷元五种成分的良好分离和鉴别。其中，12组样品中均能鉴别出远志酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、远志糖苷A 3个成分，故这3个成分能够实现远志药材的特征鉴别；其中根据细叶远志皂苷、远志皂苷元色谱斑点清晰程度，可用于评价远志皂苷类活性成分质量优劣。通过研究发现薄层色谱鉴别可用于远志不同品种、不同采集期、不同制品及其伪品的鉴别评价。有助于药典收载远志品种的质量评价标准的提高，为远志的等级划分及新的质量标准制定提供参考依据，为其质量规范化研究提供支持。

（2）薄层色谱-生物自显影研究 生物自显影色谱技术是一种集分离、鉴定和活性测定于一体的药物筛选方法，筛选方法简便、快捷。采用薄层色谱生物自显影技术可以高效快速地对植物提取物中具有AChE酶抑制活性的物质进行筛选[10]，活性成分可在薄层板上直观显现斑点，通过层析板上的斑点大致预计几个具有高活性的抑制剂的存在。本文利用生物自显影色谱分析远志药材各成分对AChE酶的抑制作用，发现远志糖苷C对乙酰胆碱酯酶有抑制作用，为远志中AChE酶天然抑制剂的快速寻找和活性成分跟踪研究提供帮助。