福建省某规模化猪场种公猪精液PRRSV检测及ORF7基因序列分析

杨小燕，魏春华，戴爱玲，戴 巍，刘建奎

(龙岩学院生命科学学院 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室 福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建 龙岩 364000)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种以出现猪生产功能和呼吸系统疾病的由病毒引发的传染病，常常呈现出厌食、高度发热，常在怀孕的后期出现流产、生产死亡胎儿或木乃伊胎。该病自1987年在美国首次报道以来，迅速蔓延至几乎所有的养猪国家，给养猪业造成了巨大的经济损失[1-4]。

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗原性及其不同来源，将其分为Type 1(欧洲型，EU)和Type 2(北美洲型，NA)[5]。1996年郭宝清等证实PRRS在我国存在，随后迅速传播至全国各个省份，2006年我国多个省份的猪场暴发了高发病率和高死亡率的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)感染，2013年出现了与美国毒株NADC30高度同源的NADC30-like PRRSV，进一步加剧了PRRSV的复杂多样性[3-5]。根据Shi 等[6]建立的分类标准，PRRSV 可分为 9个谱系(Lineage)。目前，我国田间流行的PRRSV毒株主要分为4类，HP-PRRSV处于谱系 8.7，NADC30-like PRRSV 处于谱系 1，QYYZ-like PRRSV处于谱系 3和VR-2332 like PRRSV处于谱系 5.1[7-8]。

为了解福建地区某一规模化猪场种公猪所感染的PRRSV的流行特点，本试验随机采集(10%比例)种公猪精液进行PRRSV检测，证实该猪场流行的毒株为谱系3的毒株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 在福建省某规模化猪场的公猪舍内按照10%的比例随机挑选17头公猪，编号为G1～G17，采集其精液作为样本，并于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要仪器与试剂 M-MuLV反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶和pMD19-T，均购自TaKaRa公司；RNA simple Total RNA Kit、Universal DNA Purification Kit和感受态细胞DH5α，均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 PCR引物设计 参考文献[9]设计引物，用于扩增ORF7基因序列。目的片断大小为570 bp。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及RT-PCR 将精液反复冻融3次后按照RNA提取试剂盒说明书提取精液中的RNA，按照说明书制备其cDNA，以其为模板进行ORF7基因的PCR扩增，最终得到的PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 目的基因的克隆与序列分析 将目的基因胶回收纯化后克隆至pMD19-T载体并转化到Trans T1感受态细胞中，涂板后置于37 ℃培养箱12 h过夜，鉴定为阳性的重组菌送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序，利用MEGA6.0和DNASTAR软件对PRRSVORF7基因进行遗传变异分析，本试验序列比对所用的毒株信息见表1。

表1 本试验使用的PRRSV毒株信息

2 结果

2.1 PRRSVORF7 RT- PCR扩增 17份样品的RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，有9份样品在约570 bp位置出现目的条带，大小符合预期(图1)。

2.2 序列分析 测序结果表明，该猪场9份的PRRSVORF7基因之间的同源性为100%，与谱系3中GM2、QYYZ和FJFS的同源性最高，为92.7%～93.8%；与JXA1、HuN4等HP-PRRSV毒株同源性为90.3%～91.9%，与VR2332和MLV的同源性为91.9%～92.5%；而与NADC30的最低,为89.5%(图2)。

图1 ORF 7 基因RT -PCR扩增结果Fig.1 Amplification of ORF 7 gene by RT-PCRM：DNA Marker DL-2 000； -：阴性对照； 1～17：G1～G17M：DNA Marker DL-2 000; -：Negative control; 1～17：G1～G17

遗传进化树结果表明，所测毒株与QYYZ、GM2和FJFS等谱系3毒株处于同一进化分支，亲缘关系较近，而与VR2332、CH-1a、NADC30、JXA1和HuN4处于不同的进化分支，亲缘关系较远(图3)。

图2 9株PRRSV ORF 7基因序列同源性比对Fig. 2 Comparison of nucleotide sequences of ORF 7 of nine PRRSV strains with isolates

图3 PRRSV ORF 7基因遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree of the ORF 7 of PRRSV strains

3 讨论

PRRS在近年来不断给养猪业带来很大的冲击，尤其是引起大规模的死胎、流产现象，这给猪场带来非常大的经济损失，并且PRRSV变异很快，这就使得防控方面很难做到位。福建省某规模化猪场2018年1～3月以来，不断出现母猪产死胎、木乃伊胎、流产等情况，临诊初步怀疑为猪繁殖与呼吸综合征，送检的死胎中检测出有PRRSV，但是送检母猪组织中并未检测出PRRSV。研究表明，公猪精液是多种病原传播的良好媒介，对于疫病的传播起着重要作用，PRRSV感染种公猪后可在其精液中检测到病毒[12]，为了从根本上杜绝疫病的继续发生，以及查出疫病传播源头，因此从种公猪角度出发，按照10%的比例，随机抽取17份公猪精液样品进行PRRSV检测，结果表明，9份精液PRRSV呈阳性，样品阳性率为52.7%，表明存在种公猪通过精液向母猪传播PRRSV的风险。因此，猪场应加强种猪精液检测，及时淘汰携带PRRSV的种公猪，及时切断传染源控制PRRS的传播和流行。

从基因序列分析同源性比对结果中可以看出，该场公猪精液9份阳性样品中PRRSV的ORF7基因之间的同源性为100%，与谱系3的QYYZ、GM2和FJFS的同源性最高，为92.7%～93.8%；而与JXA1、HuN4等HP-PRRSV代表毒株，VR2332和MLV弱毒疫苗株等经典毒株，NADC30、FJZ03等NADC30-like毒株的同源性较低，分别为90.3%～91.9%、91.9%～92.5%和89.5%。遗传进化树结果表明，所测毒株与QYYZ、GM2、FJFS等谱系3毒株亲缘关系较近，处于同一分支，而与JXA1、HuN4、VR2332、CH-1a及NADC30等代表毒株亲缘关系较远。因此，该猪场所测毒株为新流行的谱系3毒株。

目前减毒活疫苗已成为控制PRRS的重要手段，但是由于PRRSV易变异的特性，使得其在防控方面非常的复杂，虽然PRRSV-MLV疫苗可以诱导机体产生免疫保护反应，但并不能对所有毒株起到有效的交叉保护作用[10-11]。谱系3的毒株与现有的商品化疫苗株处于不同遗传分支，现有的弱毒疫苗是否能对其起到良好的免疫保护作用需要进一步研究。