三种方法提取的清香木叶精油的抗氧化和抑菌活性研究

李晓娇，杨丽华，陈玉梅，曹凯红，何健民

(保山学院 资源环境学院，云南 保山，678000)

清香木(Pistaciaweinmannifolia) 属漆树科黄连木属植物，为常绿灌木或小乔木，别名香叶树、紫柚木、青香树，性喜温暖、耐干热[1-2]。分布于我国云南中西部、北部及四川南部等海拔在1 000～2 700 m的干热河谷地带[3]。清香木的树皮、树叶、果实等可用来提取芳香油，还可供药用，有消炎解毒、收敛止泻功效[4]。

目前精油的提取方法主要有共水法、水蒸气蒸馏法、溶剂浸提法、超临界流体法、亚临界CO2萃取法、超声辅助提取法、微波辅助提取等[5-8]，其中使用最广泛的是共水蒸馏、水蒸气蒸馏法和同时蒸馏萃取法，由于共水法操作简单、设备便宜，但蒸馏时间长精油成分易分解[9]，因此本文为缩短蒸馏时间采用了超声辅助-共水法(ultrasonic assisted-common water method，UWD)、微波辅助-共水法(microwave assisted-common water method，MWD)和有机溶剂萃取-共水法(同时蒸馏萃取法)(simultaneous distillation extraction，SDE)3种方法提取清香木叶精油。

近些年，国内外对清香木叶挥发性成分及其生物活性研究还相对较少，周葆华[10]采用水蒸汽蒸馏法提取清香木叶挥发油，并使用气相色谱质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用技术测定出28种化合物。随后，又采用杯碟法和Alamarblue法检测了其抑菌和抗肿瘤活性[11]，研究发现清香木叶挥发油中的活性成分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、红酵母均有较强的抑制活性，对体外肺癌株细胞具有较强的杀灭作用。蔡宝国等[12]则采用顶空固相微萃取和GC-MS从清香木中分离出76 种化合物，乔永峰等[4]采用蒸馏萃取和GC-MS 联用法从清香木的绿叶和嫩红叶中分别分离到了45和48种化合物。综上所述，对清香木叶的研究主要集中在成分分析和抑菌活性方面，而对提取工艺和抗氧化活性方面的研究还鲜有报道，本研究希望通过UWD、MWD和SDE 3种方法提取清香木叶精油，并测定其主要成分，考察每种精油的抗氧化和抑菌活性，以期为拓展清香木叶在医药、食品、化妆品工业中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清香木叶于2019年10月采摘于保山学院。

无水乙醚、无水乙醇、无水NaSO4、抗坏血酸、二甲亚砜、NaOH(均为分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2-联氮-双-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)、没食子酸丙酯(propylgallatum，PG)，酷尔化学北京科技有限公司；庆大霉素，上海沃凯化学试剂有限公司；大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌，本校微生物实验室保存；葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂，石狮市环球琼胶工业有限公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9082型电热恒温培养箱、HWS-12电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；JJ-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；UV2600紫外可见分光光度计，岛津；SK250HP超声清洗机，上海科导超声仪器有限公司；G80F23CN3L-C2微波炉，广东格兰仕微波生活电器制造有限公司；V-5100可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 清香木叶精油的提取方法

1.3.1.1 超声辅助-共水法提取清香木叶精油(UWD精油)

参照华燕青等[13]的方法略加改动，将鲜清香木叶剪至2～3 mm小段，称取100 g样品，置于1 000 mL圆底烧瓶中，按照1∶5 (g∶mL)加入500 mL蒸馏水，置于超声清洗机中，功率250 W超声20 min后取出，共水蒸馏至精油馏出量不再增加(3 h)，收集玻璃分水器中上层精油，并用无水Na2SO4干燥，过滤，得无色透亮清香木叶精油，4 ℃下保存，备用。出油率的计算如公式(1)所示：

(1)

1.3.1.2 微波辅助-共水法提取清香木叶精油(MWD精油)

参照李静等[14]的方法，前处理方法同1.3.1.1,将样品置于微波炉中，功率480 W加热7 min后取出，共水蒸馏至精油馏出量不增加(3 h)，收集玻璃分水器中上层精油，并用无水Na2SO4干燥、过滤，得淡黄色透亮清香木叶精油，4 ℃下保存、备用。

1.3.1.3 同时蒸馏萃取法提取清香木叶精油(SDE精油)

参照龙园园等[15]的方法样品前处理方法同1.3.1.1，同时连接蒸馏萃取装置，一端接口连接装有样品的圆底烧瓶并置于电热套中加热，另一端接口用250 mL圆底烧瓶装80 mL乙醚恒温水浴加热，调整水浴温度为35 ℃。冷凝回流3～4 h，始终保持大圆底烧瓶中为微沸状态，加热完毕后冷却片刻，收集乙醚萃取液，蒸馏除去乙醚，得清香木叶精油，置于4 ℃冰箱中保存，备用。

1.3.2 三种方法提取的清香木叶精油的成分分析[16-17]

采用GC-MS对3种方法提取的清香木叶精油进行成分分析。气相色谱条件为色谱柱子型号DB-17, 规格30 m×0.25 mm×0.25 μm，载气为He，进样口温度为230 ℃，流量为1.0 mL/min，升温程序：起始50 ℃，保持4 min；5 ℃/min升温到70 ℃；20 ℃/min升温到120 ℃；10 ℃/min升温到170 ℃；5 ℃/min升温到200 ℃；40 ℃/min升温到280 ℃。质谱条件为离子源为EI，电离能70 eV，离子源温度为200 ℃。

1.3.3 三种方法提取的清香木叶精油的抗氧化活性测定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

参考邢玉娟等[18]的方法略有改动，用95%乙醇分别将3种方法提取的清香木叶精油配置成质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/mL 的精油溶液。将2.0 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)和2.0 mL 不同质量浓度的精油样品溶液混合均匀，于暗处放置30 min，以95%乙醇为参比，在517 nm 处测定混合溶液的吸光值A。将DPPH溶液用等体积95%乙醇溶液代替，与2.0 mL精油样品溶液混匀后在暗处静置30 min并测吸光值A0，再将精油溶液用等体积95%乙醇溶液代替，与2.0 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)混匀后在暗处静置30 min并测吸光值A1，每一个精油浓度平行进行3次实验取平均值，抗氧化剂PG作为阳性对照。按公式(2)计算DPPH·清除率：

(2)

1.3.3.2 ABTS+自由基清除能力的测定

参考王芳等[19]和权美平等[20]的方法，取等体积的2 mmol/L ABTS溶液与70 mmol/L过硫酸钾溶液混合后于暗处反应12 h，得ABTS+·溶液，后用95%乙醇稀释，使其在734 nm处吸光度为0.70±0.05，此吸光度值即为A0。用95%乙醇分别将3种不同方法提取的清香木叶精油配制成质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/mL的精油溶液。将0.2 mL不同质量浓度精油样品加入3.8 mL ABTS+·溶液中，待反应15 min后测其吸光度A1。抗氧化剂PG作为阳性对照。所有测定平行进行3次取平均值，按公式(3)计算ABTS+·清除率：

(3)

1.3.4 三种方法提取的清香木叶精油的抑菌活性测定

1.3.4.1 培养基制作

固体培养基：称取牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，NaCl 15 g，量取蒸馏水1 000 mL，煮沸到琼脂全部融化，调节pH为7.2～7.4，121 ℃、0.1 MPa高压蒸汽灭菌30 min，灭菌后于超净工作台中向培养皿中倒入约25 mL培养基，冷却后倒置培养皿，备用。

液体培养基：称取牛肉膏0.9 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 1.5 g以蒸馏水配置300 mL pH 7.4～7.6的液体培养基。121 ℃、0.1 MPa高压蒸汽灭菌30 min，备用。

1.3.4.2 菌种的活化[21]

无菌环境，接种环划线将供试菌种接种于固体培养基内，37 ℃培养72 h。菌种培养：配制液体培养基，高压灭菌处理冷却后分别接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，放置于培养箱中37 ℃培养20 h，使菌种浓度达到106～107CFU/mL，即紫外分光光度计最大吸收波长(600 nm)处测定吸光度在1.4～1.5。若吸光度<1.4，则继续培养至适宜浓度。若吸光度>1.5，则需加适量无菌生理盐水稀释。

1.3.4.3 三种方法提取的清香木叶精油的抑菌效果测定

采用二倍稀释法[22]，用二甲亚砜配制质量浓度为0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005 g/mL的精油溶液，并采用滤纸片法[23]测定不同质量浓度精油对3种菌的抑菌圈直径。用移液枪吸取150 μL(106～107CFU/mL)菌液，均匀涂布于待用的培养皿表面，将已灭菌的6 mm的圆形滤纸片平铺在培养皿表面，每个培养皿放3个滤纸片，在分别移取5 μL的精油溶液滴在3个滤纸片上，然后将培养皿倒置于37 ℃的生化恒温培养箱中培养24 h，观察抑菌情况，十字交叉法用游标卡尺测量各个抑菌圈的直径(mm)，记录数据，结果取重复实验的平均值来评价抑菌效果。以二甲亚砜溶液为空白作对照试验，试验平行3次。

1.3.4.4 三种方法提取的清香木叶精油的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度测定

用液体培养基以二倍稀释法对3种精油进行稀释，配制10 mL质量浓度为0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005 g/mL的培养基精油混合溶液于25 mL试管中，冷却后加入0.1 mL[(1.0～10)×106CFU/mL]供试菌菌悬液，35 ℃恒温培养24 h，取1 mL培养液涂布于平板培养基上，再在35 ℃下恒温培养24 h 后，观察细菌生长情况，以完全无菌生长的浓度为其最低抑菌浓度(minimum inhibtion concentration，MIC)。再分别从精油浓度不低于MIC 的试管中取1 mL培养液涂于平板培养基上，于35 ℃下继续培养24 h。以无菌生长或菌落总数5的精油浓度为最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)[24]。

1.4 数据处理

试验重复3次，采用Excel、Origin 9.5软件作图，SPSS 22.0统计软件分析。

2 结果与分析

2.1 三种方法提取的清香木叶精油的GC-MS成分比较

通过GC-MS对3种方法提取的清香木叶精油的化学成分进行分析，UWD法、MWD法、SDE法提取的精油分别鉴定出12、10、10种化合物，占峰面积的95.42%、97.00%、98.01%，结果如表1所示。由表2可知，3种方法中出油率最高的为MWD法，其次是UWD法，而SDE法的出油率比前2种方法要低，这是因为在蒸出溶剂乙醚时，有部分精油随之蒸出。3种方法提取的清香木叶精油主要是萜烯类化合物，均含有较高的α-蒎烯(UWD精油40.62%、MWD精油59.53%、SDE精油34.69%)，该结果与乔永锋等[4]研究得到的清香木叶精油的主要成分相同，但与周葆华[11]和蔡宝国等[12]研究得到的清香木叶主要成分有所差别，可能是由于环境、地域的不同造成挥发成分的组成和含量不同。UWD精油和SDE精油的主要成分基本相似，其 α-蒎烯、(S)-(-)-柠檬烯、(+)-香橙烯的总含量超过70%，而MWD精油的主要成分中没有(S)-(-)-柠檬烯和(+)-香橙烯，但含有较高含量的γ-松油烯(13.42%)、α-侧柏烯(11.82%)。α-蒎烯有松木、针叶及树脂样的气息，因此3种方法提取的清香木叶精油均有松木香味，且较为浓郁，形成了云南清香木具有独特芳香气味。

表2 三种方法提取的清香木叶精油的主要成分比较

表1 三种方法提取的清香木叶精油的GC-MS成分

2.2 三种方法提取的清香木叶精油的抗氧化活性比较

2.2.1 三种方法提取的清香木叶精油对DPPH·清除率

如图1所示，3种方法提取的清香木叶精油对DPPH·有一定的清除能力，且清除率随着精油质量浓度的增加而增大。在质量浓度为0.01 g/mL时，MWD精油清除 DPPH·的能力要强于UWD和SDE精油，清除率为19.80%，在精油质量浓度为0.02～0.06 g/mL时，DPPH·的清除率能力为PG>UWD精油>MWD精油>SDE精油，当质量浓度达到0.06 g/mL时，UWD精油和MWD精油清除率分别达到了95.00%和90.63%，清除能力与PG相近。由表3可知，PG对DPPH·的清除能力的IC50为0.002 g/mL，而3种方法提取的清香木叶精油对DPPH·的清除能力的IC50在0.023～0.027 g/mL，与强抗氧化剂PG相比效果相对较差，但是也表现出了一定的抗氧化活性。

图1 不同浓度的3种清香木叶精油对DPPH·的清除能力

2.2.2 三种方法提取的清香木叶精油对ABTS+·清除率

如图2所示，3种方法提取的清香木叶精油对ABTS+·具有较好的清除能力，且均随着浓度的增加而增大，当精油质量浓度为 0.01～0.06 g/mL时，3种精油清除ABTS+·的能力为PG>SDE精油>MWD 精油>UWD 精油。但精油质量浓度为0.06 g/mL时，MWD 精油和SDE 精油对ABTS+·的清除能力大于90%，其中SDE精油清除能力可达95.20%，与PG的清除能力接近。由表3可知，PG对ABTS+·的清除能力的IC50为0.001 g/mL，而3种方法提取的清香木叶精油对ABTS+自由基的清除能力的IC50在0.010～0.017 g/mL。

表3 三种方法提取清香木叶精油的IC50

图2 不同浓度的清香木叶精油对ABTS+·的清除能力

2.3 三种方法提取明清香木叶精油的抑菌活性比较

2.3.1 三种不同方法提取的清香木叶精油的抑菌活性结果

根据抗菌素抑菌圈实验结果判定标准[25-26]，极敏：抑菌圈直径>20 mm；高敏：抑菌圈直径15～20 mm；中敏：抑菌圈直径10～15 mm；低敏：抑菌圈直径7～9 mm；不敏感：抑菌圈直径<7 mm。由表4可知，当精油质量浓度为0.64 g/mL 时，枯草芽孢杆菌对3种精油为高敏，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对3种精油为中敏，当精油质量浓度为0.32 g/mL 时，枯草芽孢杆菌对3种精油为中敏，而金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为低敏。虽然3种精油的抑菌活性均比庆大霉素低，但作为天然植物精油已经具有较好的抑菌活性，可应用于食品和医疗美容等行业。

表4 三种方法提取的清香木叶精油的抑菌活性

注:滤纸片直径(6 mm) 包含在测量结果中，“-”表示无抑菌圈

2.3.2 三种不同方法提取的清香木叶精油的MIC和MBC

如表5所示，比较精油对3种菌的MIC和MBC，3种精油对枯草芽孢杆菌的抑制作用均高于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，其中UWD精油对枯草芽孢杆菌的MIC和MBC分别达到了0.005 g/mL和0.01 g/mL，而对大肠杆菌的MIC和MBC为0.04 g/mL，抑菌效果差别较大。比较3种精油的抑菌(MIC)和杀菌(MBC)活性，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌：UWD精油>MWD精油>SDE精油；对大肠杆菌的MBC，UWD精油>MWD精油>SDE精油；对大肠杆菌的MIC，UWD精油>MWD精油和SDE精油，而MWD精油与SDE精油的MIC相当。富含蒎烯[27-29]、柠檬烯[30]的精油对大肠杆菌等细菌有一定的抑菌活性，UWD精油中含有较高含量的蒎烯和柠檬烯，因此具有较好的抑菌活性。

表5 三种方法提取的清香木叶精油的MIC和MBC 单位：g/mL

3 结论

(1) MWD法提取的清香木叶精油的提取率最高为2.03%，其次是UMD法提取1.78%，最后是SDE法提取0.93%。3种方法提取的精油，萜烯类化合物含量最高，其中UWD法、MWD法和SDE法提取的精油蒎烯的含量分别为44.68%、62.67%、36.85%，UWD法和SDE法提取的精油中含有较多的柠檬烯，而在MWD法提取的精油中没有柠檬烯。

(2) 3种方法提取的清香木叶精油都具有良好的抗氧化活性，当精油质量浓度为0.05 g/mL时，超声-辅助共水法(UWD)精油对DPPH自由基的清除率达到了92.40%，同时蒸馏萃取(SDE)精油对ABTS+自由基的清除率达到了89.46%。

(3) 3种方法提取的清香木叶精油对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有不同的抑菌效果，当精油质量浓度为0.64 g/mL 时，枯草芽孢杆菌对3种精油为高敏，3种精油对枯草芽孢杆菌的抑制作用均高于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

从抗氧化和抑菌活性来看，清香木叶精油作为绿色天然的抗氧化剂和抑菌剂在食品、化妆品行业具有一定的开发潜力。