使用全自动酶免工作站进行酶联免疫吸附试验的效果评估

张鹏 魏巍 李玉燕 王怀娜 包丹丹 赵清华 丁爱君 郭龙宗

摘  要：利用Freedom EVO 150全自动酶免工作站结合商品化ELISA试剂盒，建立检测动物血清样本的自动化高通量酶免检测方法，评估其可靠性和稳定性，并探讨其在兽医卫生领域的应用前景。选取高、中、低抗体滴度的三组血清样本、商品化的标准品血清及实验室自制的质控品血清，在相同的实验条件下使用全自动酶免工作站和纯手工操作同时进行四个项目的检测。通过两种检测方法结果对比，可发现二者的结果具有平行性和一致性，且各质控品的检测结果都在正常范围内。本文初步建立了四个项目的自动化检测方法，并将其应用于日常大批量检测，从而大大提高工作效率和降低实验员的劳动强度。

关键词：自动化;Freedom EVO;酶免工作站;酶联免疫吸附试验

中图分类号：S851.4+1     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2020）7-0010-05

当今科技飞速发展的时代，自动化检测技术正逐步进入兽医卫生领域，建立自动化、标准化的动物疫病检测实验室体系已是一种趋势。全自动酶免工作站通常有移液机械臂、移板机械臂、孵育模块、洗板模块、读数模块、控制电脑和软件等组成，它可根据客户的具体实验需求进行编程，自动化的完成酶免实验的加样、孵育、洗板、读数等实验过程，配合商品化ELISA试剂盒可建立一整套完成的檢测体系。2019年底，本单位购置Freedom EVO 150全自动酶免工作站一套，结合商品化ELISA试剂盒和手工检测，对其可靠性和稳定性进行了评估。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  样本血清  350份鸡血清样本采集自胶东半岛某养殖场，分别对禽肺病毒（APV）、禽传染性支气管炎（IB）、禽败血支原体（MG）、禽滑液支原体（MS）四个项目进行手工检测，每个项目选取高、中、低抗体滴度，各29份血清。

1.1.2  标准品与质控品  血清标准品购自荷兰BioChek公司（批号：FR16）;自制质控品选取中等抗体的鸡血清混合后离心分装制成，其抗体的效价经多次检测已有参考范围。

1.1.3  主要试剂  禽败血支原体ELISA抗体检测试剂盒（荷兰BioChek公司，批号：FS7650）;禽滑液支原体ELISA抗体检测试剂盒（荷兰BioChek公司，批号：FS7713）;禽传染性支气管炎ELISA抗体检测试剂盒（荷兰BioChek公司，批号：FS7510）;禽肺病毒ELISA抗体检测试剂盒（美国IDEXX公司，批号：S101）。

1.1.4  主要仪器  Freedom EVO 150全自动酶免工作站（瑞士Tecan公司）;Wellwash 洗板机（美国ThermoFisher公司）;MK3酶标仪（美国ThermoFisher公司）。

1.1.5  Freedom EVO 150 全自动酶免工作站主要参数和布局图  主机平台（含扩展台）长195cm，深78cm，高120cm;台面具有45个轨道，最多可平铺放置28块标准孔板，具有96通道移液机械臂和移板机械臂，双机械臂相互独立可平行工作;密闭式温控孵育模块位于台面后方，可放置12块板，温控范围：室温在5～53℃;储板架位于台面后方，可放置24块板;洗板模块位于右侧扩展台的上方，具有96通道洗板头;读数模块位于右侧扩展台的下方，具有12个测量通道，波长范围为：400～700nm，1nm步进;装有控制软件的控制电脑。台面布局见图1。

1.2  方法

1.2.1  试剂和样本准备  实验开始前，所有试剂及被检血清样本恢复至18～26℃，试剂和被检血清样本应轻轻地旋转或震荡予以混匀。预先将自制质控品和被检血清样本标记好孔位置转移到96孔稀释板中。将浓缩洗板液配置成工作浓度的洗板液。

1.2.2  待测样本的稀释  将自制质控品和被检血清样本进行500倍稀释。向稀释板中加入190μL和240μL样本稀释液，分别取10μL标记好孔位置的自制质控品和被检样本加入到已经准备好的190μL样本稀释液中，充分混匀;再取10μL混合后的样本加入到已经准备好的240μL样本稀释液里混匀，完成对自制质控品和被检样本的500倍稀释。稀释步骤分别用全自动酶免工作站完成和实验员手工操作完成。

1.2.3  酶联免疫吸附试验  手工操作参考四个项目试剂盒中的操作说明书进行。自动化操作先由工作站厂家工程师参考相应的试剂盒说明书进行编程，实验员按照提示运行相应的程序直至检测完成。

2  结果

2.1  一致性测试结果  测试结果见图2～图5。

从图2～图5可见，自动化操作和手工操作的结果具有平行性和一致性。

2.2  稳定性测试结果

2.2.1  阴阳对照计算公式：阴性对照平均值（NC X）=（NC1+NC2）/2;阳性对照平均值（PC X）=（PC1+PC2）/2。

2.2.2  标准品和自制内控品结果计算公式：标品或内控品S/P值=（标品或内控品OD值-NC X）/（PC X-NC X）;禽肺病毒（APV）Log10滴度=1.09×（Log10 S/P）+3.36;禽传染性支气管（IB）Log10滴度=1.0×（Log10 S/P）+3.62;禽败血支原（MG）Log10滴度=1.1×（Log10 S/P）+3.156;禽滑液支原体（MS）Log10滴度=1.27×（Log10 S/P）+3.156。

2.2.3  测试结果：根据上述公式可计算出标准品和自制内控品的滴度，其测试结果分别见表1～表4。

由表1～表4可发现，各项目标准品和自制质控品的检测滴度均在参考范围内。

3  讨论

1971年，瑞典斯德哥尔摩大学Peter Perlmann和 Eva Engvall、荷兰欧伽侬公司的Anton Schuurs和Bauke van Weemen以及法国巴斯德研究所的Stratis Avrameas等人分别独立地发表了辣根过氧化物酶HRP标记的应用文章，建立了酶联免疫分析方法[1]。20世纪80年代，基于临床免疫分析的市场需求以及电机和微处理器技术的发展，第一台真正的自动化移液工作站得以被开发[2]。20世纪90年代，作为自动化移液工作站开发最早和应用最广泛的领域，具有广阔前景和巨大用户体量的自动化酶免市场不断刺激多个厂家投入其中，并不断开发出一代代的自动化酶免分析系统，从最初的单通道、双通道移液到后来的8通道和96通道移液。我国引入自动化酶免工作站的历史可以追溯到上世纪90年代末期。本世紀的最初十年，随着医院和血站的酶免检测如火如荼的开展[3，4]，全自动酶免工作站的应用也达到顶峰。近年来，随着自动化检测技术逐步进入兽医卫生领域，全自动酶免工作站也开始被广大动物疫病实验室的工作人员熟知和使用。

本研究选取禽肺病毒（APV）、禽传染性支气管炎（IB）、禽败血支原体（MG）、禽滑液支原体（MS）四个项目的商品化ELISA检测试剂盒对待检血清样本、自制内控品、标准品分别使用全自动酶免工作站和手工检测进行平行性测试和稳定性分析，可以得出自动化检测具有可靠性和稳定性的结论。基于此结论，本实验室建立多个项目的自动化检测方法，并应用于日常大批量检测。

全自动酶免工作站是由机械臂、孵育模块、洗板模块、读数模块等部分组成的大型综合设备，它可以全自动完成酶联免疫吸附实验的整个过程，包括稀释、加样、孵育、洗板、读数、结果判读等过程[5]。全自动酶免工作站可以根据用户的实验需求进行配置，从而分别满足高通量和灵活性的要求，亦可兼顾。全自动酶免工作站提高工作效率的核心在于多任务平行进行的工作模式，简单地说就是利用第一块板的孵育时间，进行后续板子的加样进板。由于孵育时间是有限的，所以加样速度就决定了后续的进板数量，也就决定了整个流程的批处理量。另外，由于每块板孵育完成后都需要进行洗板，洗板也成为重要的限速步骤。基于这两点，我们选择配置96通道移液机械臂进行稀释、加样和加试剂，配置96通道高速洗板机进行洗板，以适合大批量集中检测。孵育作为酶免试验耗时最多的步骤也是非常重要的，为了避免边缘效应、避光和防蒸发，建议使用密闭式孵育塔。需要注意的是，使用全自动酶免工作站进行大批量检测时须注意尽量选用同一批号的试剂盒。与手工操作相比，自动化检测对于试剂的消耗也更多，也需要与操作人员进行一定时间的磨合，才能实现良好的人机交互。总之，不同的实验室需基于自身的应用需求选择更适合自身的自动化产品。

全自动酶免工作站可全面提升我们实验室的自动化和标准化水平，使实验的稳定性和重复性都得到显著提高和完善，在降低实验人员劳动强度情况下提高了工作效率，缩短了重复劳动时间，使科研工作者可以将更多的时间投入到广阔的研究领域中。

参考文献：

[1]  Wide L， Porath J. Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies[J]. Biochem Biophys Acta， 1966，30： 257-60.

[2]  Lequin，R.M.Enzyme Immunoassay （ELISA）/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay （ELISA）[J].Clinical Chemistry， 51（12）：2415-8.

[3]  朱美芹， 王莉莉. Tecan Freedom Evolyzer-2200全自动酶免疫分析仪应用评价[J].实用医技杂志， 2013， 020（010）：1090-1092.

[4]  戴蕾，毕永春，宋景秋，等.TECAN Freedom EVOlyzer全自动酶免分析一体机的应用体会[J]. 医疗卫生装备， 2012， 033（008）：135-136.

[5]  吴再辉.全自动免疫工作站的设计开发[D].长春：长春理工大学，2018.