芙蓉乳腺宁凝胶膏剂促渗剂的考察*

万 静，陈晓兰，杨晓梅，杨敬鸿，陈 瑶，杨芳芳，缪艳燕

(1贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2毕节医学高等专科学校，贵州 毕节 551700)

芙蓉乳腺宁凝胶膏剂是本课题组正在研制的一种治疗急性乳腺炎的新型经皮给药制剂。该制剂具有避免肝脏首过效应、维持恒定血药浓度、作用持续时间长等优势。但通常情况下，经皮给药难以透过皮肤天然屏障，到达病灶部位起到治疗作用。在剂型中加入促渗剂能够有效解决这一难题，透皮促渗剂主要是通过帮助药物穿过角质层和表皮来增加药物透皮速率、累计透皮量，筛选合适的促渗剂也是外用药的关键[1]。本实验以芙蓉乳腺宁凝胶膏剂中主要成分穿心莲内酯为指标，从常用的促渗剂氮酮、薄荷脑、丙二醇中筛选出较佳的促渗剂及浓度，为优选芙蓉乳腺宁凝胶膏剂促渗剂提供参考。

1 材料

1.1 试药

穿心莲内酯对照品(批号：L-001-160520，纯度>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；硝酸纤维素膜(批号：20181227，南京宏哲生物科技有限公司)；肉豆蔻酸异丙酯(批号：Y17D9S77792，源叶生物)；氮酮(批号：20140517，郑州益康化工有限公司)；薄荷脑(批号：201803，云天药业)；丙二醇(批号：170926，西陇化工股份有限公司)；聚乙二醇400(批号：1410201，西陇化工股份有限公司)。

1.2 仪器

RYJ-12B型药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器有限公司)；1260型高效液相色谱仪(安捷伦)；DKZ-5A水浴恒温振荡器(上海精宏实验仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 穿心莲内酯的含量测定

2.1.1 穿心莲内酯对照品溶液的配制

精密称取0.004 41g穿心莲内酯对照品，置干燥的10 mL容量瓶中，加甲醇适量超声溶解，放冷，定容至刻度，摇匀，制得1 mL含0.4410 mg穿心莲内酯的对照品溶液。精密量取1 mL 0.441 mg·mL-1穿心莲内酯对照品，加甲醇稀释至10 mL，摇匀，制得1 mL含穿心莲内酯0.0441 mg的对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的配制

将制备好的芙蓉乳腺宁凝胶膏剂剪成面积为2.80 cm2，加50 mL 70%乙醇超声1 h，放冷，补重，过滤，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.1.3 色谱条件

色谱柱：Dikma-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈：0.2%的磷酸水(25∶75)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：225 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.1.4 专属性考察

分别取穿心莲内酯对照品、供试品溶液和不含穿心莲纯化物的阴性样品，按“2.1.3”项下色谱条件测定，结果表明穿心莲内酯分离度好，且在出峰处无干扰，见图1。

A.对照品；B.供试品溶液；C.阴性样品溶液；1.穿心莲内酯。图1 穿心莲内酯的HPLC色谱Fig．1 HPLC chromatograms of andrographolide

2.1.5 标准曲线的绘制

精密量取2 mL 0.441 mg·mL-1穿心莲内酯对照品溶液，加甲醇稀释定容至10 mL，制得1 mL含穿心莲内酯0.088 2 mg的对照品溶液，按“2.1.3”项下依次进样1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、20 μL，记录穿心莲内酯峰面积(Y)，以峰面积对进样量(X)进行线性回归，得到穿心莲内酯回归方程为Y=2088.4X+2.5565(r=0.9999)，结果表明，穿心莲内酯在0.0882～1.764 μg进样量范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.1.6 精密度试验

取同一浓度(0.044 1 mg·mL-1)的穿心莲内酯对照品溶液，按“2.1.3”项下连续进样6次，记录穿心莲内酯峰面积，其RSD值为0.83%，说明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验

取“2.1.2”项下同一供试品溶液，室温下于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h按“2.1.3”项下进样，记录穿心莲内酯峰面积，其RSD值为1.20%，说明供试品在24 h内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验

按“2.1.2”项下制备供试品溶液6份，按“2.1.3”项下色谱条件进样，计算穿心莲内酯含量，其RSD值为2.82%，说明该方法重复性好。

2.1.9 加样回收试验

取已知穿心莲内酯含量的芙蓉乳腺宁凝胶膏剂6份，精密称定，分别加入穿心莲内酯对照品1.5657 mg，按“2.1.2” 项下方法制备供试液，“2.1.3”项下色谱条件进样，计算回收率。结果穿心莲内酯的平均回收率为101.71%，RSD为1.66%，表明该方法准确可靠。

2.2 芙蓉乳腺宁凝胶膏剂促渗剂的筛选

2.2.1 接收介质的筛选

分别配制生理盐水，10%乙醇生理盐水，30%PEG400乙醇生理盐水与PEG400∶乙醇∶生理盐水(3∶3∶4)作为接收介质。

称取过量木芙蓉叶与穿心莲纯化物于10 mL离心管中，加入2 mL“2.2.1”项下不同的接收介质，密封，涡旋10 min，使纯化物充分混合均匀。置于37 ℃恒温震荡槽中震荡24 h，使纯化物溶解达到平衡。上述平衡液于离心机离心10 min，转速10000 r·min-1，取上清液0.1 mL，加甲醇稀释定容至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，按“2.1.3”项下色谱条件进样，记录穿心莲内酯峰面积，计算其在上述接收介质中的浓度，结果见表1。

表1 穿心莲内酯在各接受介质中的饱和浓度Tab.1 Saturated concentration of andrographolide in each receiving medium

由表1可知，一贴芙蓉乳腺宁凝胶膏剂中穿心莲内酯的总量为3.1313 mg，6.5 mL生理盐水、10%乙醇生理盐水、30%PEG400乙醇生理盐水、PEG400∶乙醇∶生理盐水(3∶3∶4)含穿心莲内酯的量依次为15.7346 mg、16.9670 mg、29.7596 mg、59.2001 mg，PEG400∶乙醇∶生理盐水(3∶3∶4)作为接收介质时能满足穿心莲内酯的漏槽条件，因此，以PEG400∶乙醇∶生理盐水(3∶3∶4)为接收介质[2]。

2.2.2 透皮屏障的制备

将0.45 μm孔径的硝酸纤维素膜剪为面积4 cm2左右，放置烧杯中，用肉豆蔻酸异丙酯浸泡24 h，取出，用干净滤纸轻轻擦拭表面多余液体，备用。

2.2.3 体外透皮试验及计算参数

将“2.2.2”项下制备的硝酸纤维素膜固定于Franz扩散池的接收池与供给池之间，接收池放置颗粒大小的磁力搅拌子，注入6.5 mL接收介质(使用前超声脱气20 min)，供给池中给予固定大小(2.8 cm2)的芙蓉乳腺宁凝胶膏剂，确保接收介质与透皮屏障间无气泡存在。调节水浴温度至37±1 ℃，磁力搅拌速度300 r·min-1，分别于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h分别取样2 mL，同时补入同量等温的空白接收介质。将取的接收液经0.45 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，按“2.1.3”项下色谱条件进样，记录穿心莲内酯的峰面积，按公式计算其单位面积累计渗透量(Q)、透皮速率常数(Jss) 和增渗倍数( enhancing rate，ER)[3]，以各时间点穿心莲内酯单位面积累计渗透量(Q)对时间(t)进行方程拟合。

式中，Qn为第n个时间点单位面积累计渗透量，Cn为第n个取样时间点的质量浓度，V为Franz扩散池接收池中的总体积(6.5 mL)，Ci为第i(i≤n-1)个取样点测得的药物质量浓度(μg·mL-1)，Vi为实际取样的体积(2 mL)，A为有效扩散面积(2.80 cm2)，Jss促渗剂为经加促渗剂处理后透皮速率常数，Jss空白为未加入促渗剂的透皮速率常数[4]，透皮速率常数为Q-t方程中直线斜率。

2.2.4 促渗剂的筛选

以穿心莲内酯24 h单位面积累计渗透量为指标，在预试验基础上，以0.5%、1%、3%氮酮，3%、5%、7%、9%薄荷脑，1%、3%、5%丙二醇为单一促渗剂，1.5%薄荷脑+1.5%丙二醇、1.5%氮酮+1.5%丙二醇、1%氮酮+7%薄荷脑、1%氮酮+3%丙二醇、7%薄荷脑+3%丙二醇为混合促渗剂，分别制备不含促渗剂芙蓉乳腺宁凝胶膏剂(空白)及含不同促渗剂的芙蓉乳腺宁凝胶膏剂。按“2.2.3”项下方法进行透皮试验，计算穿心莲内酯Q24h、Jss、ER等参数，结果见表2。

表2 芙蓉乳腺宁凝胶膏剂促渗剂的筛选Tab.2 Comparison of penetration enhancers for FurongRuxianning gel ointment

结果表明，单一促渗剂中，3%氮酮、3%薄荷脑对穿心莲内酯透皮有抑制作用。薄荷脑的促渗效果与浓度有正相关关系，促渗效果：9%薄荷脑>7%薄荷脑>5%薄荷脑>3%薄荷脑，氮酮的促渗效果为：1%氮酮>0.5%氮酮>3%氮酮，丙二醇的促渗效果为：3%丙二醇>1%丙二醇>5%丙二醇。混合促渗剂中，1.5%薄荷脑+1.5%丙二醇对穿心莲内酯有抑制作用，混合促渗剂促渗效果依次为：1%氮酮+7%薄荷脑>7%薄荷脑+3%丙二醇>1%氮酮+3%丙二醇>1.5%氮酮+1.5%丙二醇>1.5%薄荷脑+1.5%丙二醇。

由穿心莲内酯24 h单位面积累计渗透量可知，3%丙二醇对穿心莲内酯促渗效果较好，24 h单位面积累计渗透量为513.475 μg·cm-2，增渗倍数为1.32。

2.2.5 芙蓉乳腺宁凝胶膏剂体外透皮行为

将含3%丙二醇促渗剂的芙蓉乳腺宁凝胶膏剂透皮数据进行零级方程、一级方程以及Higuchi方程拟合[5]，结果见表3。

表3 芙蓉乳腺宁凝胶膏剂方程拟合Tab.3 Equation fitting of Furong Ruxianning gel ointment

结果表明，拟合方程中零级方程相关系数最高，芙蓉乳腺宁凝胶膏剂中穿心莲内酯的体外经皮渗透符合零级动力学方程，芙蓉乳腺宁凝胶膏剂能均匀持续释放药物，有利于药物在体内维持平缓的血药浓度，皮肤是其透皮主要限速因素[6]。

3 讨论

芙蓉乳腺宁凝胶膏剂的君药为木芙蓉叶，木芙蓉叶中芦丁、异槲皮苷成分的含量低，不能满足漏槽条件，实验中发现，即使透皮时间为24 h，也并未检测到两者的含量，因此，将含量较高的穿心莲内酯为透皮指标。

经皮渗透试验为了真实地模拟人的体内环境，需要保证药物透皮扩散过程处于恒温状态。文献报道[7]，用于治疗皮肤病，透皮扩散池温度一般选择32 ℃，若药物需透过皮肤进入毛细血管达到治疗作用，则选择37 ℃。根据本剂型治疗的疾病，确定透皮扩散池的温度为37 ℃。

体外透皮试验中，常用的透皮屏障有鼠皮、人工膜。鼠皮与人的皮肤结构相似，但鼠皮做透皮屏障时需去除鼠毛和皮下脂肪，物理脱毛对老鼠皮肤损伤小，但操作麻烦，化学脱毛对鼠皮损伤较大，去除皮下脂肪存在操作不易控制等问题，使得实验平行难以控制。硝酸纤维素膜属水溶性物质，是分子量的原理使有效成分透过，为了模拟人的皮肤结构，在使用前，需用脂溶性的肉豆蔻酸异丙酯浸泡。目前，人工膜作为透皮屏障较为普遍，而且储藏方便，实验平行易于控制。因此，本实验以硝酸纤维素膜做芙蓉乳腺宁凝胶膏剂的体外透皮屏障，筛选其促渗剂。

通过促渗剂优选的结果可知，3%丙二醇一元促渗剂单独使用效果比二元促渗剂效果好，可能是偏水溶性的丙二醇比偏脂溶性的氮酮或薄荷脑更容易使脂溶性穿心莲内酯透过凝胶膏剂中的水溶性基质[8]。