贵州金花茶种质资源ISSR分析及指纹图谱库构建

罗在柒 陆 俊 李荣京 李 治 珍李兰

（贵州省林业科学研究院，贵州贵阳550005）

贵州金花茶的模式标本于1958年由中国科学院植物研究所的曹子余先生采自贵州省册亨县山区，被鉴定为中越山茶（Camellia indochinensisMerr），1993年昆明植物所的阁天绿等将其定名为贵州金花茶［1］，但张宏达等进一步将分布在册亨的论证为离蕊金花茶（Camellia liberofilamentaH.T.Chang et C.H.Yan）［2］，分布于贵州省南部罗甸县大亭乡的金花茶为贵州金花茶。贵州金花茶自然分布地域狭窄、种群数量少，加之遭受人为采挖、生境破坏等影响，如今野生植株数量甚微，野生种群处于濒危灭绝的状态。

贵州金花茶除了归属金花茶组共享“植物界的大熊猫”“茶族皇后”等声誉外，其皆具观赏价值、开发应用价值和科学研究价值。其花具有极高的观赏价值，富含微量元素、氨基酸，以及黄酮、多糖等400多种人体必需的活性成分物质［3-5］。前期研究表明，贵州金花茶除具备茶饮保健功能外，还具有药用功效，尤其在眼疾、皮肤病、心脑血管类后遗症、糖尿病、高血压、高胆固醇、高血脂和肠胃消化系统等疾病康复方面均有不俗表现［6-9］，具备食用和药用开发价值。

简单重复序列间区（Inter-simple Sequence Repeat，ISSR）［10］分子标记技术的引物设计简单，多态性丰富，重复性好，成本低，同时兼有扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、简单重复序列标记（Simple Sequence Repeats，SSR）和随机扩增多态性DNA标 记（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）分子标记的优点，已被应用于植物品种鉴定、遗传图谱构建、基因定位和辅助育种等研究［11，12］。

近年来，贵州省罗甸县把金花茶产业作为发展地方经济、助力脱贫攻坚的主抓产业，但是产业发展面临种苗繁育、种植问题，尤其是急需摸清种质资源特征，因此要把好种苗源头关。因此，本研究采用ISSR分子标记技术，开展对现存资源遗传多样性和DNA指纹图谱特性的研究，对进一步深度开发和利用贵州金花茶奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

贵州金花茶（Camellia guizhouensisS.Y.Liang et T.L.Ming）新鲜叶片分别采集于罗甸县冒井镇大亭社区原生地周边村寨、罗甸境内企业以及贵州省林业科学研究院树木园引种植株（见表1）。试验采用3个原生植株和8个引种植株，将普通油茶（Camellia oleiferaAbel.）作为对照。

表1供试样品采集信息

由加拿大哥伦比亚大学设计100条ISSR引物序列UBC，编号依次为UBC 001～100。DNA提取试剂盒、琼脂糖、Good View核酸染料、100 bp DNA ladder、2×Tap Master Mix和50×loading Buffer等均为BIOMIGA公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取及检测。称取0.5 g新鲜叶片，液氮磨碎，使用BIOMIGA公司试剂盒提取DNA样品，经1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为110 V、30 min。将成功提取的DNA样品放入-40℃冰箱保存。

1.2.2 PCR扩增及检测。使用上海生物技术有限公司合成的100对ISSR引物进行PCR扩增，选出其中多态性条带较好的20对引物进行多态性扩增。PCR反应体系为总量20μL，其中2×Tap Master Mix 10μL、引物2μL、DNA模板1μL、ddH2O 7μL。

PCR扩增程序如下：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，52℃退火30 min，72℃延伸30 min，35个循环，72℃退火5 min。

PCR检测采用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增结果进行电泳，电泳条件为电压110 V、80 min。之后在Tanon-2500数码凝胶图像分析仪上拍照保存，进行条带分析。

1.2.3 数据分析。使用NTSYS2.1软件对各样品的PCR扩增结果进行聚类分析，做出相应聚类图，分析各品种间的遗传距离。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增与遗传多样性分析

获得高质量的DNA为模板，对100对通用引物进行筛选，共选出22对扩增效果较好、条带清晰的引物序列。扩增出的条带大小在100～1 300 bp，共扩增出440条带，其中多态性条带为385条，多态性占比为87.5%，结果表明供试材料的ISSR多态性较丰富。

利用5条引物扩增出来的440谱带建立11个金花茶品种的遗传相似系数矩阵，见表2。各样品之间的相似系数在0.39～0.84，平均相似系数为0.66，说明贵州金花茶样品具有较高的遗传多样性。其中，田坝组1号和县城益丰缘苗圃基地相似系数最大，为0.84，表明2个样品之间的亲缘关系相对较近；五湖公司基地9号与普通油茶相似系数最小，仅为0.39，表明9号与其他样品的亲缘关系相对较远，该植株为广西引种，是否为贵州金花茶需进一步鉴定。

2.2 贵州金花茶亲缘关系聚类分析

对这22对引物做进一步筛选，共筛选出扩增效果较好、特异性强的UBC817、UBC825、UBC827、UBC844和UBC845这5对引物，共扩增出76个不同位点，其中多态性位点为63处，多态性为82.89%。Ntsys2.10软件对11种金花茶的ISSR结果进行聚类分析，结果见图1，系数为0.693时，10个贵州金花茶供试样品分为2个组，即1号、2号、3号、4号、7号为一组，5号、6号、9号、10号为另一组，8号普通油茶作为对照组。

2.3 特异条带分析与指纹图谱构建

使用选定的5个扩增条数多、条带清晰、特异性强的引物用作11供试样品的指纹图谱构建。扩增结果如图2至图6所示，U817号引物扩增的条带大小在130～700 bp，共扩增出18位点，多态性位点为14处，多态性占比77.7%，可区分1号、2号、5号、7号、11号；U825号引物扩增的条带大小在190～1 100 bp，共扩增出19条带，多态性条带为17条，多态性占比89.5%，可区分6号、9号、11号；U827号引物扩增的条带大小在200～1 250 bp，共扩增出16条带，多态性条带为12条，多态性占比75%，可区分4号；U844号引物扩增的条带大小在100～600 bp，共扩增出12条带，多态性条带为8条，多态性占比66.6%，可区分3号。U845号引物扩增的条带大小在120～830 bp，共扩增出12条带，多态性条带为8条，多态性占比66.6%，可区分3号。根据10个ISSR引物的扩增结果，筛选出引物UBC017、UBC025、UBC027和UBC045扩增的51个多态性位点构建的DNA指纹图谱，可用于鉴定供试10个贵州金花茶样本。

表2遗传相似系数矩阵

3 结论与讨论

本试验采用ISSR分子标记对10份贵州金花茶材料进行遗传多样性分析，结果表明贵州金花茶材料之间遗传变异较丰富，同时呈现地域差异小的特点。样品遗传聚类分为2组，与调查过程中发现花瓣小花和大花2个类型相吻合，小花类型相对原生性相对较强，大花类型形态与离蕊金花茶较为相似，两者之间的亲缘关系仍值得深入研究。

本研究结果表明ISSR分子标记对贵州金花茶的亲缘关系具有很好的分类效果，可为贵州金花茶育种的亲本、杂种优势选择以及苗木品质鉴别提供理论基础，对物种保护和产业化育苗种苗鉴别提供技术支持。