齐墩果酸糖苷化衍生物的合成及其抗A549活性的研究

邓代艳，王 欢，张勇民，董登祥▲

(1贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2贵州威门药业股份有限公司，贵州 贵阳 550018；3法国索邦大学 法国国家科研中心，巴黎 75005)

齐墩果酸(Oleanolicacid，OA，结构式如图1)是齐墩果烷型的五环三萜类化合物，又名庆四素，多以游离、与糖结合成苷的形式广泛存在于自然界各类植物中，如女贞子、白花蛇舌草、大枣、枇杷叶、木瓜、青叶胆等[1-3]，齐墩果酸为白色结晶性粉末，无臭无味，分子式为C30H48O3。OA具有较多生理活性和药理作用，主要有保肝、抗肿瘤、抗癌、抗溃疡、抗HIV、抗炎等作用[4-10]。

图1 齐墩果酸

目前OA在临床上运用的制剂种类较为单一，生物利用度不够理想，其所具有的生物活性并未得到充分的开发利用，并存在着药代动力学指标未达到临床标准，水溶性差等亟待解决的问题，影响了其在临床上的应用，发展新剂型和制备OA衍生物仍然是解决生物利用度低、增强临床疗效的重要途径。因此，为了改善其药代动力学性质，以齐墩果酸为先导化合物进行结构修饰近些年逐渐成为研究热点问题。García-Granados等[11]将齐墩果酸的C环转化为环己二烯结构，然后光照开环得到齐墩果酸的三烯衍生物，并且成功将齐墩果酸的C环断裂，得到了以AB环和DE环为基本骨架的合成子。近年来，齐墩果酸构效关系的衍生物研究主要是在其母核的3位羟基、12位碳的位双键和28位羧基进行结构修饰，而活性研究表明具有对抗肿瘤、保护肝脏、抗炎症等药理作用，结果显示部分齐墩果酸衍生物活性高于其母体化合物[12]。齐墩果酸连接不同的糖片段其生物活性也不同[13]，C-3羟基形成糖苷键可增强活性。糖类药物生物活性较多，毒副作用小，而糖参与了人体生命几乎全部过程，因此糖类药物对于治疗人类各种疾病具有广阔的发展前景。已有大量研究表明，糖链对三萜类化合物的生物活性关系密切，糖链的改变可能对皂苷的活性产生较大影响。洪开文等[14]通过糖苷化对常春藤进行结构修饰后，得到的糖苷衍生物显著的提高了常春藤的水溶性，同时增强了体外抗肿瘤细胞的活性。

本文以葡萄糖、半乳糖、岩藻糖为起始原料，对糖上羟基进行保护与去保护，得到一系列的岩藻糖和二糖片段，通过对甲苯硫基和硫苷化途径，利用合成的糖片段对齐墩果酸C-3位羟基进行结构修饰，获得2个糖苷化衍生物。新化合物都经MS、1H-NMR、13C-NMR进行验证。采用MTT法，选用高表达人肺癌细胞(A549)对2～3进行初步的体外抗肿瘤活性研究。本研究为今后齐墩果酸及其衍生药物开发与应用提供了依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Heidolph-4000旋转蒸发仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；INOVA-400核磁共振仪；WFH-203B三用紫外分析仪；MA110电子天平；SZ-93自动双重水蒸馏器。

L-岩藻糖、D-半乳糖、D-葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；齐墩果酸对照品，纯度≥99%，南京源植生物科技有限公司；齐墩果酸-28-羧甲酯(1)按文献合成[14]；乙基-S-2，3，4-三-O-乙酰基-L-吡喃岩藻糖苷(a)，对甲基-苯基-S-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-6-O-苄基-3-O-乙酰基-2-去氧-2-邻苯二甲酰亚胺基-β-D-吡喃葡萄糖苷(c)，实验室自制；吡啶，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；CNCl3，化学纯，国药集团化学试剂有限公司；其余所用试剂均为分析纯。体外抗A549活性租借科研楼实验中心细胞室进行细胞筛选完成。

1.2 目标化合物的合成(图2)

图2 目标化合物的合成路线

(1)2的合成

称取100 mg(0.29 mmol)化合物a和204 mg(0.42 mmol)化合物1于50 mL干燥圆底烧瓶中，加入一粒搅拌子，再加入130 mg NIS和50 mg 4Å Ms，抽真空，并通入N2保护反应体系。向圆底烧瓶中加入适量无水DCM(约10 mL)使其充分溶解，将反应体系置于冰盐浴条件下搅拌，平衡10 min后加入5 μL的TfOH，反应一直在冰盐浴中进行，经TLC检测反应完全(显色剂为5%H2SO4-C2H5OH溶液，展开剂为Cy/EtOAc = 2∶1)。向反应溶液中加入饱和NaS2O3溶液中和过多的NIS，淬灭反应，至反应液的颜色由红色变为无色，再加入饱和NaHCO3溶液中和过多的TfOH，用DCM/H2O萃取反应液，收集有机相层(下层)，用无水MgSO4干燥，过滤，减压蒸去溶剂获得粗产品，用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为Cy/EtOAc = 3∶1，浓缩得120 mg化合物b，产率为56.7%。

称取30 mg(0.09 mmol)b化合物于50 mL圆底烧瓶中，加入一粒搅拌子，加入约5 mL MeOH溶液使其溶解；另称取50 mg金属钠，迅速加入20 mL无水MeOH溶液中，制备MeONa溶液，向圆底烧瓶中缓慢加入新制的MeONa溶液，用pH试纸调节使反应体系的pH在12～13之间，室温搅拌反应，经TLC检测反应完全(显色剂为5%H2SO4-C2H5OH溶液，展开剂为Cy/EtOAc = 1∶1)。向反应液中加入强酸性阳离子交换树脂调pH = 6左右，过滤，减压浓缩，真空干燥得粗产物，用HL-20凝胶柱纯化粗产物，洗脱剂为MeOH，浓缩得22 mg化合物2，产率为88.3%。

波谱数据：ESI-MS m/z：639.3[M+Na]+。

1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：5.48(1H，brt，J=2.8Hz，H-12)，5.25(1H，d，J=8.0Hz，H-1'Fuc)，4.88(1H，m，H-3)，3.71-4.12(7H，m，H-2'，H-3'，H-4'，H-5'，H-6'Fuc)，3.61(3H，s，OCH3)，2.85(1H，d，J=4.8 Hz，H-18)，1.88-2.03(3H，m，3×OH)，1.22-1.79(22H，m，H-1，H-2，H-5，H-6，H-7，H-9，H-11，H-15，H-16，H-19，H-21，H-22)，1.15(3H，s，H-27)，1.01(3H，s，H-26)，0.95(3H，s，H-30)，0.92(3H，s，H-23)，0.90(3H，s，H-24)，0.80(6H，s，H-29)，0.74(6H，s，H-25)。

13C-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：180.4(C-28)，144.9(C-13)，123.8(C-12)，107.4(C-1'Fuc)，86.3(C-3)，75.3(C-5'Fuc)，75.1(C-3'Fuc)，73.2(C-2'Fuc)，72.4(C-4'Fuc)，52.2(OMe)，49.6(C-9)，49.2(C-5)，48.1(C-17)，47.0(C-19)，42.8(C-4)，42.7(C-14)，40.6(C-18)，40.5(C-8)，39.7(C-1)，37.9(C-10)，34.7(C-21)，34.1(C-29)，33.9(C-22)，33.6(C-7)，31.6(C-20)，28.9(C-15)，26.5(C-27)，26.4(C-2)，24.5(C-11)，24.1(C-30)，23.9(C-16)，19.5(C-6)，17.6(C-26)，17.5(C-6'Fuc)，17.2(C-25)，16.9(C-23)，15.9(C-24)。

(2)3的合成

称取100 mg(0.11 mmol)化合物c和100 mg(0.21 mmol)化合物1于50 mL干燥圆底烧瓶中，加入一粒搅拌子，再加入30 mg NIS和100 mg 4ÅMs，抽真空，并通入N2保护反应体系。向圆底烧瓶中加入适量无水DCM(约8 mL)充分溶解反应物，将反应体系置于冰盐浴条件下搅拌，平衡10 min后加入6 μL的TfOH，反应一直在冰盐浴中进行，经TLC检测反应完全(显色剂为5%H2SO4-C2H5OH溶液，展开剂为Cy/EtOAc = 1∶1)。向反应溶液中加入饱和NaS2O3溶液中和过多的NIS，反应体系由红色变为无色，再加入饱和NaHCO3溶液中和过多的TfOH，用DCM/H2O萃取反应液，收集有机相层，用无水MgSO4干燥，过滤，减压蒸去溶剂获得粗产品，用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为Cy/EtOAc = 3∶1，浓缩得72 mg化合物A3，产率为52.3%。

取A3置于干燥圆底烧瓶中加入2 mL(0.02 mol)Ac2O和2 mLMeOH，N2保护，室温搅拌24 h，经TLC检测反应完全(显色剂为5%H2SO4-C2H5OH溶液，展开剂为DCM/MeOH=8∶1)。加入适量Tol，减压除溶剂，再用MeOH溶解，滤纸过滤，减压蒸去溶剂获得粗产品，用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为DCM/MeOH=8∶1，获得白色固体，然后再用HL-20纯化，洗脱剂为MeOH，得到19 mg白色固体产物3，收率为67.5%。

波谱数据：ESI-MS m/z：925.5[M+Na]+。

1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.24-7.37(5H，m，Ar-H)，5.47(1H，d，J=8.2 Hz，H-1Glu)，5.24(1H，brt，J=2.8 Hz，H-12)，4.91(1H，m，H-3)，3.51-4.02(15H，m，Bn-CH2，Glu-H，Gal-H)，3.63(3H，s，OCH3)，3.35(3H，s，NCH3)，3.12(1H，d，J=9.4 Hz，H-23)，2.88(1H，d，J=14，4.8 Hz，H-18)，1.89-2.05(5H，m，Glu-OH，Gal-OH)，0.78-1.74(22H，m，H-1，H-2，H-5，H-6，H-7，H-9，H-11，H-15，H-16，H-19，H-21，H-22)，1.15(3H，s，H-27)，1.00(3H，s，H-26)，0.95(3H，s，H-30)，0.93(3H，s，H-23)，0.91(3H，s，H-24)，0.86(3H，s，H-29)，0.74(3H，s，H-25)。

2 结果与讨论

2.1 化学合成

合成2～3衍生物的反应涉及单糖，二糖片段与齐墩果酸苷元的合成，该步骤是合成齐墩果酸皂苷元衍生物的关键。目标产物在反应过程中采用TLC监测反应终点，柱层析纯化，其结构通过1HNMR，13CNMR，MS得以确证。

在羧酸衍生物的制备中所使用的TFBA(四丁基氟化铵)是一种相转移催化剂。在实验的过程中，-COOH必须在NaHCO3中电离成-COO-才能反应，而CH3I只溶于DCM，所以用TFBA作为两相转移的催化剂来调和有机相与水相。CH3I只作用于C-28位的-COOH而对其他两位上的-OH没反应，是因为作用于C-28位是成酯，而另两位是成醚，各自的反应条件不同，而且NaHCO3只对-COOH起作用，故只有C-28位被置换成-Me。

2.2 细胞活性

以阿霉素为阳性对照药，采用MTT法对目标化合物进行初步的体外活性测试并计算抑制率，数据见表1。

表1 目标化合物对A549的体外抑制率

由表1可见，浓度为1×10-3mol·L-1时，2种化合物对A549的抑制活性明显较其他的浓度时要高，抑制率分别为(64.12±3.03)%；(89.25±0.12)%。其中，化合物2在最低浓度1×10-6mmol·L-1时对A549不存在抑制作用，而化合物3在各浓度下均对A549有抑制作用。

3 结语

以齐墩果酸苷元为原料，通过酯化、乙酰化及醚化等反应，合成了齐墩果酸皂苷元脂溶性衍生物(2～3)，其中2未见文献报道。目标化合物的抑制活性虽然均不如阳性对照药阿霉素，但考虑到糖苷在体内的降解过程中，还会在不同时段和部位释放出具有药理活性的苷元，因此将做进一步的动物实验，对体内药动学和药效学关系进行分析。该研究对进一步研究开发糖苷化齐墩果酸衍生物奠定了基础。