lncRNA PAX8-AS1对鼻咽癌细胞的增殖和侵袭的影响及作用机制*

侯彬， 黄维平， 尹中普， 胡守森

1南阳市中心医院耳鼻喉科(河南南阳 473000)； 2郑州大学第一附属医院耳鼻喉科(河南郑州 450052)

鼻咽癌是我国最多见的头颈部恶性肿瘤，高发于广东、广西等南方省份[1]。由于解剖部位隐匿、不易早期发现，导致大多数患者确诊时已处于中晚期[2]。鼻咽癌对放射治疗的敏感性较强，但由于鼻咽癌的恶性程度较高，中晚期患者的预后并不理想[3]。明确鼻咽癌发生、发展的分子机制有利于发现新的治疗靶点和改善鼻咽癌患者预后。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)属于非编码RNA，核苷酸长度≥200个核苷酸，可通过调控lncRNA靶基因表达，影响细胞的生物学功能[4]。近年来的研究表明，lncRNA广泛影响包括鼻咽癌在内的多种肿瘤细胞的恶性生物学行为，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[5-6]。lncRNA已成为鼻咽癌早期诊断和靶向治疗研究领域的热点。PAX8-AS1是一种新确定的lncRNA，有研究显示，PAX8-AS1在乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌等多种肿瘤中呈低表达，发挥明显的抑癌基因作用[7-8]。然而，PAX8-AS1在鼻咽癌中的作用机制国内外并无报道研究。本研究旨在检测PAX8-AS1在鼻咽癌组织及慢性鼻咽炎组织、鼻咽癌细胞株及永生化鼻咽上皮细胞中的表达，通过构建PAX8-AS1过表达细胞模型，探究上调PAX8-AS1对鼻咽癌细胞增殖和侵袭的影响，初步探讨该lncRNA在鼻咽癌细胞中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 永生化鼻咽上皮细胞(NP69)和人鼻咽癌细胞株(C666-1、HNE-1、CNE-2Z、SUNE-1和HONE-1)均购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。胎牛血清(FBS)、K-SFM培养基和RPMI 1640培养基购自美国HyClone公司。GV369-PAX8-AS1慢病毒、空载慢病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司。Trizol试剂盒、MTS试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。抗β-Tubulin、TCF21、PIP3、p-AKT、PDK1和GSK-3抗体均购自英国Abcam公司。Matrigel基质胶购自美国BD公司。qRT-PCR试剂盒和引物购自北京天根公司。

1.2 临床标本 本研究检测的83例鼻咽癌组织标本来自2017年2月至2019年8月南阳市中心医院耳鼻喉科。其中男57例，女26例，年龄34～68岁，平均(55.86±14.58)岁。根据美国癌症联合委员会鼻咽癌TNM分期系统(2010年第7版)对鼻咽癌患者分期，Ⅰ期13例，Ⅱ期26例，Ⅲ期37例，Ⅳ期7例。根据鼻咽癌WHO 病理分型(2005)版进行分型，角化癌27例，非角化性癌56例。以2019年2—6月本院62例慢性鼻咽炎患者的鼻咽黏膜组织为对照。所取标本均经病理学诊断，组织均保存于液氮中。本研究均经本院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.3 细胞培养和感染 采用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养鼻咽癌细胞株(C666-1、HNE-1、CNE-2Z、SUNE-1和HONE-1)，采用含10% FBS的K-SFM培养基培养永生化鼻咽上皮细胞(NP69)，培养条件为37℃、5%CO2。以对数生长期的CNE-2Z细胞为感染对象，接种于6孔板，当细胞密度为70%时进行感染。采用新鲜培养基按感染复数(MOI)=20稀释慢病毒原液，对慢病毒感染实验进行分组：对照组加入空载慢病毒，实验组加入GV369-PAX8-AS1慢病毒，实验组建立稳定过表达PAX8-AS1的 CNE-2Z细胞株。

1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 提取鼻咽癌组织及慢性鼻咽炎组织、鼻咽癌细胞株及永生化鼻咽上皮细胞总RNA并逆转录。根据qRT-PCR试剂盒说明书扩增检测，扩增参数：95℃(4 min)，95℃(8 s)，58℃(28 s)，72℃(28 s)，循环数设定为38。以GAPDH为内参检测PAX8-AS1和转录因子21(transcription factor 21，TCF21) mRNA的相对表达。qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 MTS检测CNE-2Z细胞增殖 收集感染后的CNE-2Z细胞，重悬后以4×103个/孔细胞密度接种至96孔板，培养箱中培养。分别于接种后第1、2、3、4、5 天采用MTS试剂盒检测两组CNE-2Z细胞的增殖。MTS检测时，每孔加入10 μL MTS溶液(浓度为10%)，继续培养，酶标仪检测光密度值。

1.6 Transwell侵袭实验检测CNE-2Z细胞侵袭 稀释Matrigel基质胶，稀释比例为1∶5，Transwell小室上室均匀铺40 μL，置于培养箱内凝固。收集感染后的CNE-2Z细胞，应用无血清的RPMI 1640培养基重悬后，以4×104个/孔的细胞密度接种小室上室，小室下室加入含血清培养基。继续培养24 h，应用棉签擦去未穿膜细胞。多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，计数每组穿膜细胞数。

1.7 Western blot 收集感染后的CNE-2Z细胞并提取总蛋白，在12% SDS-PAGE凝胶中加样进行电泳，每组40 μg蛋白样品。转膜至硝酸纤维素膜，在5%脱脂牛奶中进行封闭。制备一抗：β-Tubulin(1∶2 000)、TCF21(1∶2 000)、PIP3(1∶2 000)、p-AKT(1∶1 000)、PDK1(1∶2 000)、GSK-3(1∶2 000)， 在4℃冰箱内孵育。二抗孵育后，采用ECL发光显影液显影。

2 结果

2.1 鼻咽癌组织中PAX8-AS1的表达水平 qRT-PCR检测显示，PAX8-AS1在鼻咽癌组织的表达量(1.05±0.40)明显低于慢性鼻咽炎组织(4.13±0.68)，鼻咽癌组织中PAX8-AS1的表达水平较慢性鼻咽炎组织降低了74.58%(P=0.008)。

2.2 鼻咽癌细胞株中PAX8-AS1的表达水平 qRT-PCR 检测显示，PAX8-AS1在永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞株C666-1、HNE-1、CNE-2Z、SUNE-1、HONE-1中表达分别为1.03±0.13、0.68±0.03、0.43±0.03、0.16±0.04、0.60±0.07、0.37±0.04，与永生化鼻咽上皮细胞NP69相比，PAX8-AS1在鼻咽癌细胞株C666-1、HNE-1、CNE-2Z、SUNE-1和HONE-1中表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，其中在CNE-2Z细胞中表达水平最低(P<0.01)。

2.3 两组CNE-2Z细胞PAX8-AS1的表达水平 qRT-PCR 检测显示，在CNE-2Z细胞中感染GV369-PAX8-AS1慢病毒过表达载体或空载慢病毒，实验组CNE-2Z细胞中PAX8-AS1的表达水平(8.30±0.42)明显高于对照组(1.03±0.14)，差异有统计学意义(P<0.001)。GV369-PAX8-AS1慢病毒过表达载体可有效促进CNE-2Z细胞中PAX8-AS1的表达。

2.4 上调PAX8-AS1抑制CNE-2Z细胞的增殖能力 CNE-2Z细胞中PAX8-AS1上调后，MTS法检测显示(图1)，接种第2天开始，上调PAX8-AS1的细胞增殖能力降低(P=0.024)，表明上调PAX8-AS1可以抑制CNE-2Z细胞的增殖能力。

注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01

2.5 上调PAX8-AS1抑制CNE-2Z细胞的侵袭能力 上调CNE-2Z细胞中PAX8-AS1表达，见图2，实验组穿膜细胞数为(25.45±3.23)个/视野，对照组穿膜细胞数为(80.22±11.69)个/视野，实验组低于对照组(P=0.004)，表明上调PAX8-AS1可抑制CNE-2Z细胞的侵袭能力。

2.6 上调PAX8-AS1对TCF21 mRNA表达水平的影响 qRT-PCR实验显示，实验组和对照组CNE-2Z细胞中TCF21 mRNA表达量为3.86±0.56和1.02±0.13，实验组高于对照组(P=0.003)，上调PAX8-AS1可促进TCF21 mRNA的表达。

注:A:对照组；B:实验组

2.7 上调PAX8-AS1对TCF21蛋白和PI3K/AKT信号通路蛋白表达的作用 上调CNE-2Z细胞中PAX8-AS1表达后，TCF21蛋白呈高表达，抑癌蛋白PIP3表达明显升高，细胞增殖相关蛋白p-AKT表达减少，细胞转移相关蛋白PDK1和GSK-3蛋白减少。见图3。

图3 上调PAX8-AS1对CNE-2Z细胞TCF21蛋白和PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响

3 讨论

人类基因组90%的转录本不具有编码蛋白的功能，统称为非编码RNA，lncRNA是非编码RNA中的重要成员[9]。越来越多的研究证明，lncRNA在鼻咽癌中存在差异表达，与鼻咽癌的发生、发展密切相关[10]。

PVT1[11]、HCG18[12]、AK027294[13]、MINCR[14]、SMAD5-AS1[15]等lncRNA在鼻咽癌组织和细胞株表达明显升高，与鼻咽癌患者的肿瘤分期、分级、放疗敏感性、预后不良相关，降低其表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭的。PAX8-AS1是一种新发现的lncRNA，在多种肿瘤组织中呈低表达，上调PAX8-AS1表达可抑制肿瘤细胞的增殖和转移，是一种肿瘤抑制因子。PAX8-AS1在鼻咽癌中的表达、功能及作用机制尚不明确。

本研究结果表明，与慢性鼻咽炎组织和永生化鼻咽上皮细胞相比，PAX8-AS1在鼻咽癌组织和细胞株的表达明显降低，其中PAX8-AS1在鼻咽癌细胞CNE-2Z中的表达最低，表明PAX8-AS1可能参与鼻咽癌的发生、发展，PAX8-AS1具有成为鼻咽癌诊断标志物的潜力。MTS法和Transwell侵袭实验显示，与感染空载慢病毒比较，上调PAX8-AS1的CNE-2Z细胞增殖和侵袭能力均明显降低，PAX8-AS1在鼻咽癌细胞CNE-2Z中发挥抑癌基因作用。

TCF21定位于染色体6q23-q24，是近年来新发现的抑癌基因[16]。TCF21在卵巢癌、膀胱癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤组织和细胞株中低表达，参与肿瘤的发生、发展，与患者的临床分期、分级、生存率密切相关[17-18]。TCF21表达增加可显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力[19]。本研究显示，上调PAX8-AS1表达后，CNE-2Z细胞中TCF21蛋白的表达明显增加。PI3K/AKT信号通路活化参与鼻咽癌的发生、发展，可促进鼻咽癌细胞的增殖和转移[20]。有研究表明，TCF21蛋白可显著抑制PI3K/AKT信号通路的活化[21]。本研究显示，TCF21蛋白表达增加后，PI3K/AKT信号通路蛋白如PIP3、p-AKT、PDK1和GSK-3等表达明显降低，PI3K/AKT信号通路活化被抑制。

综上所述，PAX8-AS1在鼻咽癌组织和细胞株中呈低表达，上调PAX8-AS1可通过促进TCF21基因表达，干扰PI3K/AKT信号通路的活化，抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭能力。本研究为lncRNA在鼻咽癌早期诊断和靶向治疗研究提供了一定的实验基础。