基于QbD理念优化苦参生物碱的分离工艺

蒋建兰，单潇潇，孙 露，张凯旋

基于QbD理念优化苦参生物碱的分离工艺

蒋建兰1, 2，单潇潇1, 2，孙 露1, 2，张凯旋1, 2

(1. 天津大学系统生物工程教育部重点实验室，天津 300350；2. 天津大学化工学院，天津 300350)

质量源于设计；苦参；纯化过程；优化

近年来，质量源于设计(quality by design，QbD)原则广泛应用于生产操作当中，以确保产品质量可 控[1]．这一理念是将质量风险管理理念引入到制药工业当中，常被用来评估药品质量[2-4]和优化生产过 程[5-7]．QbD原则是在确定关键工艺参数的前提下，得出工艺指标与关键质量属性之间的数学模型，通过对模型参数的设定，建立稳定可控的设计空间[8]，使工艺操作更加灵活．

QbD理念常用于中药提取[9-10]以及剂型优化[11-13]等生产当中，而在中药分离纯化过程的相关研究较少．笔者以苦参甘草提取液中生物碱的分离纯化工艺为例，论述将QbD理念引入到中药分离纯化工艺的实验方法．苦参甘草配伍是一类常见的复方，其中苦参为主药，有清热利尿之功效，对人类的心脏、大脑、肝脏等有益[14]．苦参中的主要抗菌物质是生物碱，包括苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱等[15]，其中苦参碱和氧化苦参碱的含量最高且应用最广，因而使用这两种生物碱以及苦参总碱的解吸量作为工艺评价指标来优化分离工艺．

1 试验材料与方法

1.1 试验材料和仪器

树脂AB-8(批号20140618)、树脂D-101(批号20150316)、树脂D3520(批号20130409)、树脂NK-109(批号20160217)，购自南开合成科技有限公司；树脂XDA-5(批号20150703)、树脂S-8(批号20140505)、树脂NKA-9(批号20140607)，购自郑州勤实科技有限公司；以上树脂均用5.0% HCl和 0.2moL/L NaOH分别处理，乙醇和蒸馏水反复洗涤，最后将它们浸泡在蒸馏水中待用．

玻璃层析柱(10.0mm×350.0mm)，天津市鹏翔天达玻璃仪器经营部；高效液相色谱仪(Waters 1525，Waters 2489 紫外检测器)、Unitary C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)、紫外-可见分光光度计(UV6000)，上海元析仪器有限公司．

1.2 样品前处理

将苦参和甘草放置于45℃的恒温干燥箱里干燥至恒重，然后将7.50g苦参和10.00g甘草用70.0%的乙醇溶液回流提取2h，提取液以12000r/min的转速离心，收集上清液作为柱分离试验的上样液．

1.3 工艺评价指标的测定

溴甲酚绿紫外分光光度法用来测定TASF的含量，紫外检测波长为420nm．MT和OMT的含量采用外标法检测，液相检测系统为：Waters 1525，Waters 2489紫外检测器，色谱柱为Unitary C18(4.6mm×250mm，5μm)，在检测波长220nm、柱温30℃、流动相为水(0.1%磷酸，A)-乙腈(B)的条件下，对样品进行梯度洗脱(0～4min，95%～87%A；4～7min，87%～80%A；7～20min，80%～95%A)，进样量为20µL，流速1.0mL/min[16]．

1.4 树脂的选择

1.4.1 静态试验

分别称取7种树脂8.00g和40mL提取液混合放置于摇床当中，30℃、120r/min的条件下吸附24h．当吸附完成后，将吸附完成的树脂用10mL的蒸馏水洗涤两次，置换出树脂层中残留的提取液，然后再用45mL、70.0%的乙醇静态洗脱，解吸条件与吸附过程相同．各物质吸附量a与解吸量d计算式分别为

1.4.2 数据处理

使用“归一值”法对多量纲的数据进行处理．

根据7种树脂的静态吸附和静态洗脱过程中的OD值大小，选择最优的树脂作为柱层析动态洗脱试验中的吸附剂．

1.5 关键工艺参数的识别

1.5.1 单因素试验设计

根据实际工作中的经验，选取合适的因素，采用单一变量法来研究各参数对NK-109树脂动态吸附与洗脱提取工艺的影响，每组试验进行3次．

1.5.2 多因素显著试验设计

多因素显著试验(Plackeet-Burmann design，PBD)由design-expert 8.0软件完成．根据单因素试验结果，综合考量各因素对3种工艺评价指标的影响，在单因素试验结果中呈上升趋势的区间内，选择各因素的高低水平(高：1，低：-1)，根据试验指导原则[17]，在Plackeet-Burmann中设计12组5因素2水平的试验，得出相应工艺下的工艺评价指标值，然后对5种因素进行显著性分析，筛选出关键工艺参数．

1.6 中心点复合试验设计

中心点复合试验(central composite designed，CCD)由design-expert 8.0软件完成．根据PBD试验结果确定显著因素，即为关键工艺参数(critical process parameters，CPPs)．试验选取上样液pH值、洗脱剂乙醇浓度和洗脱流速为关键影响因素进一步优化．在Central-Composite中设计20组3因素5水平的中心点复合试验，得到相应工艺下的3种工艺评价指标值，进行回归分析．

2 结果与讨论

2.1 大孔树脂筛选结果

吸附是一种物理过程，吸附效果与吸附剂性能和吸附剂与被吸附物质之间的分子相互作用有关．试验考察了7种树脂静态吸附和解吸的效果，试验结果如表1、表2所示．比较OD值，NK-109型大孔树脂对于此次优化试验来说性能最优，因此选其为分离过程中的吸附剂．

2.2 关键工艺参数的确定

2.2.1 单因素试验结果

由图1和图2可知各因素对TASF、MT和OMT 吸附量和解吸量的影响差别较大，且同一因素对3种工艺评价指标的影响也不尽相同．随着上样流速增大，提取液中的生物碱类物质不能与吸附剂充分接触，导致物质不能很好地被吸附，吸附量降低．在提取液呈酸性时，随着pH值增大，苦参中的生物碱由离子态转变为游离态，增强了物质与树脂间的作用力，使吸附量增大，但当提取液pH值呈碱性时，部分生物碱与甘草中的酸性物质发生反应，降低了提取液中的生物碱总量，导致吸附量减少．稀释倍数越大，相同体积的提取液中生物碱含量越少，导致各生物碱的吸附量也因此减少．随着洗脱液体积增大，更多的生物碱类物质被洗脱，导致解吸量升高．与上样流速相似，当洗脱流速增大时，洗脱剂与物质之间的接触时间较短，导致解吸量降低．随着乙醇浓度升高，各生物碱的解吸量呈现不同的趋势，TASF和MT的解吸量随着乙醇浓度的升高而增大，而OMT为弱极性物质，在高浓度乙醇溶液中的溶解度逐渐降低，因此其解吸量呈现先增大后减小的趋势．根据图1和图2中数据结果，结合生产成本，选定洗脱剂体积用量为60mL，在此基础上确定其他参数的高低水平为上样流速：20.0mL/h、40.0mL/h；上样液pH值：4.5、6.5；上样液稀释浓度：不稀释、稀释2倍；洗脱剂乙醇体积分数：70.0%、90.0%；洗脱流速：20.0mL/h、40.0mL/h；设计PBD试验，筛选出关键工艺参数见表3．

表1 7种树脂的吸附量

Tab.1 Absorption capacities of seven resins

表2 7种树脂的解吸量

Tab.2 Desorption capacities of seven resins

图1 吸附过程中各因素对生物碱吸附量的影响

图2 洗脱过程中各因素对生物碱解吸量的影响

表3 PBD试验设计结果

Tab.3 PBD experimental design results

2.2.2 PBD试验结果

对各因素进行回归分析，试验结果见表4．表中数据给出了各因素对工艺评价指标的影响顺序，值越低，影响越显著．综合考察各因素影响的显著水平，选取上样液pH值、洗脱剂乙醇体积分数和洗脱流速为优化过程中CPPs，在洗脱液体积60mL、上样流速30.0mL/h、上样液不稀释的基础上进行后续试验．

表4 PBD试验结果分析

Tab.4 Analysis of PBD experiment results

注：TASF、MT和OMT的2分别为0.9381、0.9235和0.8874；上标“*”表示显著．

2.3 CCD试验结果

利用design-expert软件设计CCD试验并进行回归分析，试验结果如表5所示，CPPs与工艺评价指标间的最佳模型为二次多项式函数，d1、d2、d3分别表示TASF、MT和OMT解吸量对上样液pH值(1)、洗脱剂乙醇体积分数(2)和洗脱流速(3)的响应值，回归方程如下：

表5 CCD试验结果分析

Tab.5 Analysis of CCD experiment results

对3个回归方程进行方差分析，方程的2值分别为0.8957、0.9271、0.8874，值分别为0.0008、0.0001、0.0011，均小于0.05(显著)，失拟项值分别为0.0726、0.0734、0.1104，均大于0.05(不显著)，表明回归方程显著，模型拟合度高，且随机误差对试验结果影响较小，CPPs与3种工艺评价指标之间可用此模型函数化．

2.4 设计空间的建立

图3 分离纯化过程中的设计空间

黄色区域表示相应参数条件下，工艺指标值满足要求

表6 设计空间的验证

Tab.6 Verification of design space

注：上标“*”表示预测值．

3 结 语

［1］ Orlandini S，Pinzauti S，Furlanetto S. Application of quality by design to the development of analytical separation methods[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2013，405(2/3)：443-450.

［2］ Rathore A S. Quality by design(QbD)-based process development for purification of a biotherapeutic[J]. Trends in Biotechnology，2016，34(5)：358-370.

［3］ Sangshetti J N. Quality by design approach：Regulatory need[J]. Arabian Journal of Chemistry，2017，10(2)：3412-3425.

［4］ Peterson J J. A Bayesian approach to the ICH Q8 defini-tion of design space[J]. Journal of Biopharmaceutical Statistics，2008，18(5)：959.

［5］ Lawrence X Y，Pharmaceutical quality by design：Product and process development，understanding，and control[J]. Pharmaceutical Research，2008，25(10)：781-791.

［6］ Zhang Lan，Mao Shirui．Application of quality by design in the current drug development[J]. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences，2017，12(1)：1-8.

［7］ 徐 冰，史新元，吴志生，等. 论中药质量源于设计[J]. 中国中药杂志，2017，42(6)：1015-1024.

Xu Bing，Shi Xinyuan，Wu Zhisheng，et al. Quality by design approaches for pharmaceutical development and manufacturing of Chinese medicine[J]. Chinese Journal of Chinese Materia Medica，2017，42(6)：1015-1024(in Chinese).

［8］ 丁瑞雪，何 雁，田 香，等. 基于质量源于设计理念的地格达-4味汤提取工艺研究[J]. 中国中药杂志，2019，44(13)：2799-2805.

Ding Ruixue，He Yan，Tian Xiang，et al. Research on extraction process of Digeda-4 flavored decoction based on QbD concept[J]. Chinese Journal of New Drugs，2019，44(13)：2799-2805(in Chinese).

［9］ Wang Yaqi，Yang Yuanzhen，Jiao Jiaojiao，et al. Support vector regression approach to predict the design space for the extraction process of pueraria lobata[J]. Molecules，2018，23(10)：2405.

［10］ 蔡淑洁，吕华伟，蒋靓萍，等. 基于QbD理念的雷公藤总三萜微波提取工艺研究[J]. 发酵科技通讯，2018，47(1)：16-20.

Cai Shujie，Lü Huawei，Jiang Liangping，et al. Study on the microwave extraction process of Tripterygium wilfordii total triterpenoids based on QbD concept[J]. Bulletin of Fermentation Science and Technology，2018，47(1)：16-20(in Chinese).

［11］ Djuris J，Medarevic D，Krstic M，et al. Application of quality by design concepts in the development of fl-uidized bed granulation and tableting processes[J]. Jo-urnal of Pharmaceutical Sciences，2013，102(6)：1869-1882.

［12］ Troiano G，Nolan J，Parsons D，et al. A quality by design approach to developing and manufacturing polymeric nanoparticle drug products[J]. AAPS Journal，2016，18(6)：1354-1363.

［13］ Pallagi E，Karimi K，Ambrus R，et al. New aspects of developing a dry powder inhalation formulation ap-plying the quality-by-design approach[J]. International Journal of Pharmaceutics，2016，511(1)：151.

［14］ 张明发，沈雅琴. 苦参碱类生物碱抗粒细胞和单核细胞性白血病的药理作用研究进展[J]. 抗感染药学，2019，16(4)：559-563.

Zhang Mingfa，Shen Yaqin. Research advances on pharmacological action of matrine-type alkaloids in patients with granulocytic and monocytic leukemia[J]. Anti Infect Pharm，2019，16(4)：559-563(in Chinese).

［15］ Liu Xiujin，Cao Meiai，Li Wenhai，et al. Alkaloids from Sophora flavescens Aition[J]. Fitoterapia，2010，81(6)：524-527.

［16］ 赵 洋，张 涛，贾红梅，等. 苦参-甘草药对提取工艺的优化及其化学成分分析[J]. 中国实验方剂学杂志，2017，23(3)：18-24.

Zhao Yang，Zhang Tao，Jia Hongmei，et al. Optimization of extraction process for couplet medicines of sophorae flavescentis radix-glycyrrhizae radix et rhizoma and identification of its chemical constituents[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2017，23(3)：18-24(in Chinese).

［17］ 张润楚，刘民千，杨建峰，等. 试验应用统计[M]. 北京：机械工业出版社，2010.

Zhang Runchu，Liu Minqian，Yang Jianfeng，et al. Test Application Statistics[M]. Beijing：Mechanical Industry Press，2010(in Chinese).

Application of a Quality by Design Approach to Optimize Separation of Alkaloids in

Jiang Jianlan1, 2，Shan Xiaoxiao1, 2，Sun Lu1, 2，Zhang Kaixuan1, 2

(1. Key Laboratory of Systems Bioengineering of Ministry of Education，Tianjin University，Tianjin 300350，China；2. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China)

quality by design；；purification process；optimization

R932

A

0493-2137(2020)11-1204-07

10.11784/tdxbz201910032

2019-10-21；

2020-01-02.

蒋建兰（1972—  ），女，博士，研究员.

蒋建兰，jljiang@tju.edu.cn.

国家自然科学基金青年科学基金资助项目(81102900).

Supported by the Young Scientists Fund in the National Natural Science Foundation of China(No. 81102900).

(责任编辑：田 军)