不同剂量浓度二陈汤对PCOS 模型大鼠性激素水平和卵巢形态学的影响

王维斌，张 萍，陈锦明，俞 洁

（福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育龄期妇女常见的生殖功能障碍和内分泌代谢功能紊乱并见的复杂性疾病，临床表现以卵巢多囊样变、长期持续无排卵以及月经不调、多毛、肥胖等症状为主。目前认为下丘脑-垂体-卵巢轴调节功能紊乱所导致的高雄激素血症和高黄体生成素血症，是导致PCOS 发生内分泌功能紊乱的主要原因［1-2］。 现代医学对于 PCOS 的治疗多采用手术、促排卵、降低雄激素等对症治疗，通过改善临床症状以提高生活质量，但存在着毒副作用较大，容易复发的问题［3-4］。 中医学认为：痰是导致 PCOS 发生发展的重要病理基础，从痰论治PCOS 的理论依据由来已久［5-7］。 二陈汤出自《太平惠民和剂局方》，是化痰的基础方。 但由于人与大鼠在吸收中药的效率和剂量浓度方面存在差异，适用于人体的药物剂量浓度并不完全适用于大鼠。二甲双胍是近年来临床中治疗 PCOS 的常用药，疗效颇受认可［8］，因此，本研究通过设置低、中、高剂量二陈汤，以二甲双胍作为阳性对照，探究二陈汤治疗PCOS模型大鼠的最适剂量浓度， 为深入研究二陈汤治疗PCOS 模型大鼠的作用靶点提供实验基础。

1 实验材料

1.1 实验动物 21 日龄 SD 雌性大鼠 36 只，SPF级，体质量（50±10）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（许可证编号：SCXK（沪）2017-0005，合格证编号：2015000558815），饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF 级屏障系统（许可证编号：SYXK（闽）2014-0005），饲养环境恒温、恒湿，温度（20±2）℃，湿度 40%～60%，12 h 周期性光照环境，普通饲料喂养（各成分热量比例为：碳水化合物60%，蛋白质22%，脂肪10%，包括纤维素在内的其他成分8%），除实验期外自由饮食、饮水。本实验所有相关动物实验操作都按照动物伦理审查标准严格进行。

1.2 试剂和药物 二陈汤组方根据《太平惠民和剂局方》二陈汤的原方，处方：陈皮15 g，姜半夏15 g，茯苓9 g，炙甘草4.5 g。 由福建中医药大学附属第三医院药剂科制备，严格按照2015 年版《中国药典》规范，4 ℃条件下保存备用。 二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，规格：0.5 g/片，批号：AA20897）；脱氢表雄酮（DHEA，上海麦克林生化科技有限公司，批号：328C022）；注射用大豆油剂（上海源叶生物有限公司，规格：500 mL/瓶，批号：T15S9Z70260）；大鼠睾酮ELISA 试剂盒、大鼠黄体生成素ELISA 试剂盒、大鼠卵泡刺激素ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；HE 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180727）。

1.3 实验仪器 Premium U570 型超低温冰箱、5424R 型微型冷冻离心机（美国Eppendorf 公司）；EG1150H 型生物组织包埋机、Histocore Pearl 型全封闭组织脱水机、RM2245 型石蜡切片机（德国Leica 公司）；SHP-250 型生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；Infinite M200 Pro 型多功能酶标仪（奥地利 Tecan 公司）；Axio Imager A2 型显微镜（德国 Carl Zeiss 公司）。

2 实验方法

2.1 模型建立 参照张晓薇等［9］推荐的改良法，选取21 d 龄SD 雌性大鼠36 只，适应性喂养2 d 后，按体质量随机分为正常组6 只和造模组30 只。 造模组将 DHEA 按 6 mg/100 g 体质量溶于0.2 mL 注射用大豆油剂，每日进行皮下注射于颈背部，连续20 d。正常组于颈背部皮下注射0.2 mL 注射用大豆油剂，连续 20 d。 于造模10 d 后，行两个性周期（10 d）的大鼠阴道脱落细胞涂片，观察大鼠动情周期的变化，并定期观察体质量和摄食情况。

2.2 模型评价 造模第10 天开始观察大鼠阴道脱落细胞变化情况，连续观察2 个周期。 正常组阴道涂片按照动情间期、动情前期、动情期、动情后期规律进行；造模组阴道涂片则以黏液和白细胞为主，动情间期延长，失去规律动情周期。

2.3 分组及用药治疗 将成模后造模组30 只随机分为模型组，二陈汤低、中、高剂量组（简称低、中、高剂量组），二甲双胍组，每组6 只，并以正常组作为对照。 造模结束后开始灌胃给药，按照人与动物剂量换算常规算法，即大鼠给药剂量为人的6 倍计算用药量，即为中剂量，而高剂量为中剂量的2 倍，低剂量为中剂量的1/2，据此换算出水煎液浓度。其中二陈汤低、中、高剂量组分别以2.175、4.350、8.700 g / （kg·d） ， 二 甲 双 胍 组 给 予 二 甲 双 胍0.3 g / （kg·d）灌胃 ，正常组 及 模 型组予 等体 积［10 mL /（kg·d）］灭菌饮用水灌胃。 各组分别连续干预4 周。

2.4 标本取材及处理 于末次给药当日晚8 时开始禁食不禁水。 翌日称重后，以10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉；待大鼠麻醉后，打开腹腔进行腹主动脉采血，分离血清，用于性激素水平检测；并分别完整取出双侧卵巢，剪去卵巢周围脂肪组织，用预冷的生理盐水洗净组织表面残血，置于4%多聚甲醛内，用于卵巢组织形态学观察。

3 指标检测

3.1 阴道脱落细胞涂片观察 造模第10 天开始，每日早晨9∶00 进行1 次阴道脱落细胞学观察。 将无菌棉签，浸于生理盐水中，插入大鼠阴道约0.5 cm，稍旋转，涂于玻片上，置于95%乙醇中湿固定15 min后取出，待自然风干后，行苏木素-伊红（HE）染色并观察。

3.2 性激素水平检测 采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中睾酮（T）、促卵泡激素（FSH）、促黄体生成素（LH）的含量，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。 检测在多功能酶标仪上进行检测，根据酶联免疫反应后显色的深浅即吸光度值的大小，判断标本中待测抗体或抗原的浓度。

3.3 卵巢组织形态学观察 将置于4%多聚甲醛内大鼠右侧卵巢取出，流水冲洗6 h；选取卵巢的最大平面进行石蜡包埋，蜡块分别以4 μm 厚度进行连续切片，行苏木素-伊红（HE）染色并观察。

4 统计学方法

所得数据采用SPSS 21.0 统计学软件分析。 计量资料符合正态分布的以表示，两组间比较采用独立样本T 检验，多组间比较采用One-Way Anova 进行统计处理；满足方差齐性检时，采用Least-SignificantDifference 方法；方差不齐时，采用 Dunnett T3 方法；不符合正态性分布的采用非参数检验。

5 结 果

5.1 各组大鼠阴道脱落细胞涂片变化 正常组连续4 d 阴道涂片按照动情间期、动情前期、动情期、动情后期规律进行；造模组连续4 d 阴道涂片则以黏液和白细胞为主，动情间期延长，失去规律动情周期。 见图 1。

图1 大鼠阴道脱落细胞涂片观察（×10）

5.2 各组大鼠血清T、LH、FSH 水平比较 见表1。

表1 各组大鼠血清 T、LH、FSH 水平比较

表1 各组大鼠血清 T、LH、FSH 水平比较

注：与正常组比较，1） P＜0.05，2） P＜0.01；与模型组比较，3） P＜0.05，4） P＜0.01；与二甲双胍组比较，5） P＜0.05。

组别正 常 组模 型 组低剂量组中剂量组高剂量组二甲双胍组n666666 T /（nmol/L）96.95±10.49 227.52±28.122）160.04±13.342）3）141.96±11.511）4）145.80±13.892）4）159.05±14.102）3）LH/（ng/L）26.22±3.27 44.18±3.352）41.35±2.562）37.87±2.692）3）5）40.89±4.092）37.42±5.862）3）FSH/（IU/L）20.86±2.24 28.55±1.602）25.34±1.661）3）22.58±1.524）5）22.93±1.614）5）26.72±3.922）

5.3 各组大鼠卵巢组织形态学HE 染色比较 正常组大鼠卵巢可见多个黄体及各级卵泡，颗粒细胞呈多层排列，形态完整，颗粒层多为8～9 层；模型组大鼠可见大量囊状扩张卵泡，卵巢颗粒细胞层数减少，排列疏松，可见较多闭锁卵泡，黄体少见；二陈汤低、中剂量组中可见囊状卵泡数量减少，开始出现各级卵泡，卵泡颗粒细胞层较模型组增厚，黄体增多，以二陈汤中剂量组与正常组较为接近；二陈汤高剂量组、二甲双胍组仍可见大量囊状扩张卵泡及闭锁卵泡，卵巢颗粒细胞层数减少，排列疏松，与模型组无明显差异。 见图2。

图2 各组大鼠卵巢组织形态学HE 染色比较（×50）

6 讨 论

PCOS 根据其临床表现，多属于“闭经”“不孕”“癥瘕”“月经后期”等病。中医学认为，PCOS 发病与肾、肝、脾的功能密切相关［10］。 由于肾、肝、脾三脏功能失调，导致水液代谢障碍，引起痰湿壅塞，阻滞胞宫，阻碍排卵，使得卵巢增大，包膜增厚，从而导致PCOS 发生，痰湿是导致PCOS 发生和发展的重要病理因素。

二陈汤具有燥湿化痰，理气健脾功效，是临床治疗PCOS 痰证的常用方剂，但是二陈汤治疗PCOS的作用机制仍未明确。 本研究通过设置低、中、高剂量组的二陈汤，探究不同剂量浓度二陈汤治疗PCOS 的作用机制，寻找二陈汤治疗PCOS 模型大鼠的最适剂量浓度。 实验结果显示：DHEA 诱导的PCOS 模型大鼠的 T、LH、FSH 激素水平上升，并且卵巢组织呈多囊样变，符合PCOS 临床症状表现，表明PCOS 模型大鼠建立成功。 经过不同剂量浓度的二陈汤干预治疗后，在性激素水平方面，其T、LH、FSH 激素水平均有所改善。 在卵巢形态学方面，二陈汤高剂量组及二甲双胍组与模型组差异不大，而二陈汤低、中剂量组可对PCOS 卵巢形态学有明显改善作用。 低、中、高剂量的二陈汤均可对PCOS 模型大鼠性激素水平与卵巢形态学有所改善， 说明了在PCOS 模型大鼠中存在有“痰”的病理因素，并且化痰法能够改善PCOS 模型大鼠性激素水平及卵巢形态学变化。 本研究发现中剂量二陈汤相对于低、高剂量二陈汤在改善性激素水平及卵巢形态学方面疗效更为明显，说明了二陈汤中剂量是PCOS模型大鼠的最适剂量浓度，可以为后续深入研究二陈汤化痰治疗PCOS 作用靶点提供实验基础。

本研究存在样本量较少的问题，后期可以提高样本量进行进一步实验，深入探讨二陈汤改善PCOS 性激素水平及卵巢形态学变化的具体作用靶点，挖掘中药化痰法治疗PCOS 患者的分子生物学机制，为中医化痰治疗PCOS 提供实验基础。