烹饪方式对克氏原螯虾中恩诺沙星残留的影响

黄宣运，孔聪，史永富，张璇，黄冬梅，蔡友琼*

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所； 2.农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(上海)： 上海 200090； 3.上海海洋大学 农业部鱼类营养与环境生态研究中心； 4.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心： 上海 201306)

食品安全一直是社会各界广泛关注的焦点[1-3]，现有检测标准的检测对象、检测方法的研究对象及政府的监管对象大多为未经烹饪加工的肌肉组织[4-7]，风险评估采用的药物残留暴露剂量也是以未经烹饪加工肌肉中药物残留的含量作为计算数据[8-10]。然而，在中国，绝大部分的水产品是经过烹饪后才被食用，烹饪可导致肌肉蛋白变性、水分流失以及脂肪含量和pH值改变[11-12]，也可导致肌肉中药物残留含量发生变化[13-14]。因此，开展烹饪加工方式对水产品药物残留影响研究，对水产品药物残留风险评估和提高食品安全信心具有重要意义。

恩诺沙星(enrofloxacin，ENR)是被批准允许在水产品养殖过程中使用的抗菌类药物，主要用于治疗水产动物的细菌性疾病，被广泛应用在水产养殖疾病防治过程中[15]，其在水产动物体内的残留已成为影响中国水产品质量安全的常见因素之一。为保障消费者饮食安全，欧盟、美国和中国等地区和国家均制定了水产品中ENR的最大残留限量标准(100 μg/kg)[16-17]。然而，仍有少数养殖户在养殖过程中未严格遵守用药规范，导致水产品中恩诺沙星残留超标现象仍有发生[18]。

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，俗称小龙虾，深受广大消费者的喜爱。据报道[19]2017年中国小龙虾养殖总产量为112.97万 t，需求总量约为190万 t，小龙虾消费市场持续火爆，可见小龙虾在人们的日常饮食生活中的地位正在逐步加深。目前，关于烹饪加工对肌肉中药物残留影响的研究主要集中在鸡肉[20]、牛肉[21]及猪肉[22]等畜禽产品，水产领域的研究对象仅见草鱼(Ctenopharyngodonidella)[23]、对虾(Fenneropenaeuschinensis)[13]及鲤(Cyprinuscarpio)[14]等，主要研究药物为孔雀石绿[14]、氯霉素[13, 23-24]、磺胺甲基异噁唑[24]和土霉素[24]等，尚未见烹饪方式对小龙虾中恩诺沙星药物残留影响的研究报道。

本研究采用浸泡给药方式，获得小龙虾实际阳性样品并将其制成虾丸，分别经水煮、清蒸、油炸和微波4种烹饪方式加工，测定加工前、后虾丸中恩诺沙星含量的变化，评价不同烹饪方式对小龙虾中恩诺沙星残留的影响，探讨小龙虾烹饪过程中恩诺沙星药物残留变化的主要影响因素。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小龙虾购于上海东方国际水产品批发市场，平均体质量为(25±2)g。恩诺沙星(纯度≧10%)购于北京大北农动物保健科技有限公司。恩诺沙星标准品(纯度≧98.5%)购于德国Dr公司。恩诺沙星同位素内标物(纯度≧99.0%)购于Witega公司。甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷均为色谱纯，购于美国J.T.Baker公司。甲酸(色谱纯)购于西格玛奥德里奇(中国)公司。滤膜(亲水，PTFE，0.22 μm)购于上海安谱实验科技股份有限公司。

标准溶液及内标液配制：准确称取恩诺沙星10 mg，用甲醇定容至100 mL，配制成100 μg/mL 的标准储备液，-20 ℃保存。取1 mL标准储备液，用甲醇稀释至100 mL，配制成1 μg/mL 的标准中间液。准确称取氘代恩诺沙星5 mg，用甲醇定容至50 mL，配制成100 μg/mL 的内标储备液，-20 ℃保存。取0.1 mL内标储备液，用甲醇稀释至10 mL，配制成1 μg/mL的内标中间液。取适量的标准中间液和内标中间液用流动相稀释，配制成2、5、10、25、50和100 ng/mL的标准工作液，其中内标溶液浓度为50 ng/mL。

药浴溶液配制：准确称取0.05 g的恩诺沙星药品(含量以10%计算)，用甲醇定容至100 mL，配制为50 mg/L的恩诺沙星溶液。取3 mL 50 mg/L的恩诺沙星溶液，采用倍比稀释的方式，逐步加入30 L水中，配制浓度为5 mg/L恩诺沙星药浴溶液。

1.2 仪器与设备

Thermo TSQ Quantum Ultra高效液相色谱串联质谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；Mili-Q 纯水仪(法国Millipore公司)；CF16RXⅡ型离心机(日本 HITACHI公司)；FA1004电子天平(上海精天电子仪器厂)；Vortex Genius Ⅲ型涡旋混合器(德国IKA公司)；Rotavapor®R-100旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)。

1.3 方法

1.3.1 给药方法

小龙虾放置于含5 mg/L恩诺沙星溶液的水族箱(76 cm×56 cm×40 cm)中药浴1 h后移出，用清水冲洗小龙虾3次，每次3min。

1.3.2 虾丸制备

小龙虾洗净后，去头、去尾、去肠、去壳，取其肌肉组织，制成虾仁。将300 g虾仁，放入搅拌机中，搅拌3 min，制成均匀的虾泥。再准确称取(2.00±0.05)g虾泥，制成大小均一的虾丸，经测定虾丸中恩诺沙星的残留量均值为(1 695.1±170.3)μg/kg。

1.3.3 加工方法

水煮：水加热至100 ℃时，将9个虾丸样品放入水中，盖上锅盖。在水煮2、5和10 min时，分别取出3个虾丸样品，冷却后，放入50 mL的离心管中。

清蒸：水加热至100 ℃时，将9个虾丸样品放入蒸格中，盖上锅盖。在清蒸2、5和10 min时，分别取出3个虾丸样品，冷却后，放入50 mL的离心管中。

油炸：油温热至180 ℃时，将9个虾丸样品放入油中，在油炸2、3和4 min时，分别取出3个虾丸样品，冷却后，放入50 mL的离心管中。

微波：将9个虾丸样品放入微波炉内，中火微波，在微波1、2和3 min时，分别取出3个虾丸样品，冷却后，放入50 mL的离心管中。

1.3.4 样品测定

样品测定方法参考农业部1077号公告—1—2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱—串联质谱法》。

1.3.4.1 恩诺沙星分析色谱条件

C18色谱柱(MGII，100.0 mm×2.0 mm, 5μm)，流动相A为0.1%甲酸水溶液(含2 mmol/L乙酸铵)，流动相B为甲醇；进样量20 μL；柱温40 ℃。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 The mobile phase gradient elution program

1.3.4.2 恩诺沙星分析质谱条件

ESI+离子模式，电子传输毛细管温度350 ℃，气化室温度300 ℃，鞘气(N2) 2.4×105Pa，辅助气(N2) 10 psi，碰撞气(Ar)1.5 mTorr，多反应监测，碎片离子及碰撞能量见表2。

表2 反应监测的定性离子、定量离子与碰撞能量Tab.2 The qualitative ions, quantitative ions and collision energy used for selected reaction monitoring

1.3.4.3 恩诺沙星分析前处理方法

在装入虾丸的离心管中准确加入50 μL内标标准中间液(1.0 μg/mL)涡旋混合50 s，加入15 mL乙腈(含1%甲酸，V/V)，涡旋混合1 min，超声提取10 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液于50 mL梨形瓶中。在残渣中再加入15 mL乙腈(含1%甲酸，V/V)，重复提取一次，合并两次提取液，于40 ℃旋转蒸发仪蒸至近干，分别加入1.0 mL甲醇溶液(20%，V/V)和2.0 mL正己烷涡旋混合30 s，转入10 mL离心管中，4 000 r/min 离心5 min，取下层溶液过0.22 μm水相滤膜，待液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.5 数据统计分析

利用Excel 2010对数据进行统计分析。经过不同烹饪处理后，虾丸样品中恩诺沙星的变化量，用公式(1)计算。

式(1)

式中：△T为虾丸中恩诺沙星含量减少百分率(%)；C0为未加工虾丸中的药物残留量初始浓度，(μg/kg)；Ct为加工处理后虾丸中的药物残留量浓度，(μg/kg)。

利用Excel 2010中的单因素方差分析，对各组数据间差异进行方差分析，当P<0.05时为显著差异，P<0.01时为极显著差异。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与线性范围、最低检出限

以标准物质浓度作为横坐标，以标准物和其氘代内标物峰面积的比值作为纵坐标作ENR的标准曲线。ENR标准曲线在2.0 ～100.0 ng/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y=0.107 5X+0.009 3，相关系数r≥0.999 2。经加标试验确定方法检出限为1.0 μg/kg (S/N≥3)，定量限为2.0 μg/kg (S/N≥10)，满足本试验小龙虾中恩诺沙星的定量分析。

2.2 虾丸阳性样品均匀性测定

随机抽取3个制备好的虾丸样品，测定其恩诺沙星的含量，结果(表3)显示虾丸样品的检出值在1 508.9～1 733.3 μg/kg之间，平均值为1 695.1 μg/kg，相对标准偏差(RSD)为10.0 %，RSD≤15.0 %，符合检测标准相关要求，说明虾丸阳性样品的均匀性良好，可以用于后续的烹饪模拟实验。

2.3 烹饪加工对虾丸样品中恩诺沙星残留的影响

2.3.1 水煮

水煮不同时间后，虾丸样品中恩诺沙星含量测定结果见表4。水煮2、5和10 min后(自水沸腾起计时)，虾丸样品中恩诺沙星浓度分别为1 153.4、1 130.6和1 047.4 μg/kg。与未加工虾丸样品相比，恩诺沙星含量分别减少了541.6、564.4和647.6 μg/kg。随着水煮时间的延长，虾丸中恩诺沙星的含量呈现下降趋势，水煮10 min时效果最好。按照1.2.5中公式进行计算，水煮2、5和10 min，虾丸样品中恩诺沙星浓度分别减少了32.0%、33.3%和38.2%。王唯芳[24]的研究表明，水煮9 min后，氯霉素、磺胺甲基异噁唑和土霉素分别下降了96%、82%和75%。本研究中小龙虾恩诺沙星下降效率小于其他药物，可能是不同药物在加热条件下稳定性不同所致[21]。

表3 虾丸样品均匀性测定结果Tab.3 The results of sample homogeneity of shrimp pellets n=3

2.3.2 清蒸

清蒸2、5和10 min后(自水沸腾起计时)，虾丸中恩诺沙星的含量如图1所示，按照1.2.5中公式进行计算，虾丸样品中恩诺沙星分别减少了8.6 %、20.2 %和22.0 %，判断清蒸10 min能够最大限度减少虾丸中恩诺沙星的含量。实验结果显示，随着清蒸时间的增加，虾丸中恩诺沙星的含量逐渐减少，但减少速率明显下降。在实际烹饪条件下，清蒸虾丸也不会超过10 min。由此可以推断，在实际生活中清蒸方式能够降低虾丸中恩诺沙星含量，但不能完全去除虾丸中恩诺沙星的残留。

表4 水煮加工处理后虾丸样品中恩诺沙星的残留量Tab.4 The content of ENR residue in shrimp pellets after boiling n=3

2.3.3 油炸

油炸不同时间后，虾丸样品中恩诺沙星含量测定结果见表5。油炸2、3和4 min后，虾丸样品中恩诺沙星分别减少了40.6 %、44.6 %和55.4 %，油炸4 min能够最大限度减少虾丸中恩诺沙星的含量。黄和等[13]研究发现油炸4 min时，对虾中3种氯霉素下降93.30 %～ 94.91 %，这与本研究结果相差较大，除药物种类不同外，还可能是由于样品给药方式不同，药物与肌肉结合力存在差异所致。本实验的小龙虾阳性样品为药浴给药获得的实际阳性样品，而黄和等[13]的对虾阳性样品是人工添加标准品制备而成。

表5 油炸加工处理后虾丸样品中恩诺沙星的残留量Tab.5 The content of ENR residue in shrimp pellets after frying n=3

2.3.4 微波

微波处理不同时间后，虾丸样品中恩诺沙星含量测定结果见表6。微波1、2和3 min后，虾丸样品中恩诺沙星分别减少了22.1 %、41.6 %和74.9 %，推断微波3 min能够最大限度地减少虾丸中恩诺沙星的含量。在不考虑烹饪时间的情况下，4种烹饪方式中，微波对小龙虾中恩诺沙星的消除率最高，这与Mitrowska等[14]研究结果一致，其研究表明微波处理能够最大限度的地降低鲤中孔雀石绿和无色孔雀石绿的残留。微波对小龙虾中恩诺沙星残留的影响除了温度因素外，还可能与微波辐射有关。

表6 微波加工处理后虾丸样品中恩诺沙星的残留量Tab.6 The content of ENR residue in shrimp pellets after microwaving n=3

2.3.5 不同烹饪方式对小龙虾中恩诺沙星消除效率的比较

经不同烹饪方式处理2 min后，虾丸中恩诺沙星的含量如图2所示。微波和油炸加工条件对虾丸中恩诺沙星的消除效率远高于水煮和清蒸方式，这可能与温度上升的快慢有关。4种烹饪方式中，微波方式和油炸方式都能使小龙虾样品的温度较快上升，而水煮和清蒸方式在短时间内无法使得小龙虾样品温度迅速上升，因此短时间内，微波和油炸对降低小龙虾中恩诺沙星残留效果较水煮和清蒸更为明显。这一结果，与黄和等[13]研究结果基本一致，其研究表明不同加工条件下，加工2 min后，微波和油炸均能使对虾中氯霉素的含量显著下降，其次是水煮，最后是清蒸。

经不同烹饪方式处理后，虾丸中恩诺沙星的消除率见表7。由表7可知，不同烹饪方式处理条件下，微波加工处理后的虾丸样品中恩诺沙星消除率最高，为74.9%；其次是油炸，为54.4%；再次是水煮，为38.2%；清蒸的消除率最低，为22.0%。出现这一结果的原因可能与加工方式和加热的温度有关。在这4种烹饪方式中，微波加热是依靠分子间剧烈碰撞产生热量，使物体均匀受热，且使物体中心温度迅速升高，因此对恩诺沙星的消除率最高。油炸温度为180 ℃，高于水煮和清蒸的100 ℃，因此，油炸方式对消除小龙虾中恩诺沙星的影响高于水煮和清蒸。水煮和清蒸的温度均为100 ℃，而水煮条件下小龙虾中恩诺沙星消除率高于清蒸，其原因可能是水煮条件下，虾丸中的恩诺沙星转移到加热介质水中含量高于转移到蒸汽中，相比之下，水煮条件下虾丸中恩诺沙星含量下降率更高。综上，烹饪方式和温度是影响虾丸中恩诺沙星含量的主要因素。

表7 不同烹饪方式理后虾丸样品中恩诺沙星消除率比较Tab.7 Comparison of the elimination rates of ENR in shrimp pellets by different cooking methods n=3

3 结论

在日常生活中，水煮、清蒸、油炸和微波4种烹饪方式均能够减少小龙虾中恩诺沙星的残留量，可降低其食用风险。在对小龙虾中恩诺沙星的残留进行风险评估时，考虑到烹饪可改变药物残留含量这一因素，建议对膳食暴露剂量进行修正。此外，4种烹饪方式中，微波加工对降低小龙虾中恩诺沙星含量效果最为显著，其次为油炸加工，再次为水煮，最后为清蒸，推断烹饪方式和温度是影响小龙虾中恩诺沙星降解效率的主要因素。本研究选取的烹饪处理时间点是针对相应的烹饪方式在日常中所用的时间进行设置的，时间太长会影响虾丸的食用品质，且在实际应用中不常见，故未对延长加工时间对药物残留的影响做进一步考察。本研究结果可为开展小龙虾中恩诺沙星残留风险评估和科普宣传提供数据支撑。