NCAM2基因的结构、功能及表达调控研究进展

徐子洁 安清明 王大会 贺花 文逸凡 张子敬 王二耀 雷初朝 黄永震

摘要：神经细胞黏附分子2（neural cell adhesion molecule 2，NCAM2）是一类属于免疫蛋白超家族的细胞黏附分子（CAM），该蛋白与NCAM1是旁系同源，胞外域由5个免疫球蛋白（Ig）模块和2个纤连蛋白Ⅲ型（FnⅢ）同源模块组成。多聚唾液酸（polysialic acid，PSA）是NCAM家族中的一种重要修饰，但大部分NCAM为非PSA化。NCAM2在脑组织中高表达，是许多神经发育疾病的关键调控候选基因，被认为刺激神经突生长及束缚和抑制突触成熟等。概述了NCAM2的结构、表达和生物学功能，从癌症治疗、唐氏综合征等方面介绍NCAM2的作用及研究进展，并对其存在的问题及发展方向提出展望，以期为今后的研究提供参考。

关键词：细胞黏附分子2;多聚唾液酸;生物学功能;研究进展

中图分类号：Q786   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）14-0045-05

人神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）家族主要包含NCAM1和NCAM2，与钙黏素不同，NCAM是非Ca2+依赖性的细胞黏附分子（CAMs）。近年来，研究提出NCAM家族含有相同的胞外域，5个膜远端的免疫球蛋白区域和2个纤连蛋白Ⅲ型（FnⅢ）同源区域，NCAM2胞外域通过糖基化磷脂酰肌醇（GPI）或跨膜结构域与细胞质基质连接到质膜上，又被称为嗅细胞黏附分子（OCAM）和R-8神经细胞黏附分子（RNCAM），是属于免疫球蛋白家族的细胞黏附分子（CAMs）。NCAM1和NCAM2的胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域的主要结构基本相同，提示两者结构相关但功能不完全相同。NCAM1早在20世纪70年代就被鉴定出来，而哺乳动物NCAM2的三维模型结构在1997年才出现。虽然是在20年前就发现NCAM2，但相关研究在国内外都还处于初步阶段，NCAM2的功能也只是一部分研究的重点。涉及牛脑垂体的相关研究表明，NCAM2对动物育种也有着有不可忽视的作用[1]。本文就NCAM2的结构、表达及生物学功能进行综述，探究其在畜牧业发展中的作用。

1 NCAM2的结构

1.1 NCAM2的基本结构

Paoloni等提出编码NCAM2的基因位于染色体21q21，预测NCAM2含有837个氨基酸，通过计算机程序PSORT初步证明跨膜区域主要位于氨基酸残基702 ～ 718之间[2]。利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术和X-Ray技术可以详细分析NCAM2的三维结构，发现N端5个Ig区域呈线性排列，且在IgⅤ和FnⅢ1以及FnⅢ2之间以不同方式弯曲，利用上述结构模型的模拟可以表明IgⅤ和FnⅢ1之间以及FnⅢ1和FnⅢ2之间的灵活性[3];NCAM1和NCAM2的FnⅢ的结构模型的叠加证明了2种蛋白质及结构域之间的不同角度;NCAM1中非保守氨基酸残基的单突变导致 FnⅢ1-FnⅢ2 二聚体出现不同的构象[4]。综上所述及结构模型分析，支持NCAM2中FnⅢ1-FnⅢ2接头可能也存在灵活性的观点。NCAM同型具有不同的生物学功能，但这是否因为FnⅢ1-FnⅢ2接头的灵活变化还不十分清楚，同样，NCAM2的 IgⅤ-FnⅢ1-FnⅢ2区域功能重要性也有待确定[5]。可以肯定的是，连接NCAM2同质二聚体的IgⅠ-IgⅡ链是NCAM2胞外域中最灵活的结构，推测Ig链在二聚体过程中有着重要的作用，但二聚体后灵活性降低，导致膜近端的FnⅢ结构域成为唯一的变化区域。

为进一步确定FnⅢ域的结构和功能，通过对比研究发现，NCAM1和NCAM2的FnⅢ结构域内都包括1个Walker A基序[6]，在NCAM1中ATP与Walker A结合导致NCAM1不能与成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）结合，而NCAM2相反，再一次证明了FnⅢ的灵活性。体外重组的NCAM2 FnⅢ结构域与FGFR结合，FnⅢ1-2二聚体通过激活FGFR诱导神经突以浓度依赖性的方式生长，来自NCAM2相似区域的5种多肽中只有2种能通过FGFR依赖的Ras-MAPK通路有效诱导神经突生长，这表明ATP是NCAM2在信号转导中的配体竞争物，NCAM2可以通过FGFR刺激信号转导，但其是否通过FGFR或其他生长因子受体发出信号还有待确定。

NCAM2结构模型還包括域交换[7]，指一个模块的‘Aβ链弯曲变成另一模板β-折叠的一部分，含有Ig模块的蛋白质中域交换是未知的[8]，研究表明，域交换促进受体NCAM2二聚体化[9]。首次观察到的嗜同性NCAM2相互作用是结晶状态的 IgⅠ-IgⅠ 链，Yoshihara等报道NCAM2介导的细胞-细胞嗜同性反式相互作用是在IgⅠ-IgⅡ相互作用下完成的[10]。有研究指出，蛋白NCAM2通过同源性反式相互作用（NCAM2结合相对细胞表面上的类似NCAM2），或通过嗜异性反式相互作用介导细胞与细胞外基质（ECM）的组分或邻近细胞的附着;NCAM2还可利用其胞外域与位于同一质膜中的分子顺式相互作用，甚至通过其细胞质尾部与胞质蛋白相互作用，从而调节细胞内信号级联放大机制和细胞骨架的组织。上述结论表明，NCAM2通过同源性或异质性反式相互作用介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的黏附作用，而在同一细胞或质膜上发生同源性或异质性顺式相互作用。

1.2 多聚唾液酸糖基化

多唾液酸聚糖（polysialic acid，PSA）是一类由α2，8连接的线性结构的碳水化合物，主要通过 N-连接糖苷键附着在NCAM的IgⅤ区域上，PSA由2种α2，8多聚唾液酸转移酶ST8SiaⅡ（STX）和ST8SiaⅣ（PST）催化形成[11]。NMR技术证明PSA是一种线性的螺旋结构，通过减弱同种细胞或不同细胞NCAM之间的相互作用[12-13]，降低其黏附作用，从而促进神经突向外生长，而PSA在NCAM胞外域的聚糖链对细胞识别有重要作用[14]。然而近年研究表明，PSA只附着在人NCAM1上，不与NCAM2连接，尽管NCAM2的Ig结构域上存在8个潜在的N-糖基化位点，提示NCAM2糖基位点存在着其他功能相关的未知修饰。PSA化NCAM高表达在胚胎发育期大脑中，成熟大脑中含量减少，可以推测NCAM1存在于胚胎期而NCAM2可能在发育期或者成熟期含量较多。

廖思明等运用Phyre2软件构建了精确的ST8SiaⅡ三维模型，提出该酶存在多唾液酸转移酶结构域（PSTD）和多聚碱性氨基酸区域（PBR）2个重要的功能域[15-16]，并提出功能域内相关氨基酸残基的敲除对抑制肿瘤细胞的迁移有重要意义。因此，深入研究多唾液酸载体的作用机制对肿瘤抑制物的研发有重大价值。

2 NCAM2的表达及活性控制

NCAM2不仅在哺乳动物中大量表达，而且在脊椎动物中也有表达，但是在无脊椎动物中只表达一种高度相似的NCAM同源物，表明NCAM家族在脊索动物进化过程中由于基因组重复而得以进化[17]。

2.1 NCAM2表达的时期和部位

哺乳动物NCAM2（OCAM/RNCAM）在几种组织中都有表达，但主要还是在脑中表达较高，其他组织尚不清楚。在大鼠和小鼠上，已经广泛研究了NCAM2在嗅觉系统中的表达，嗅球位于脊椎动物前脑结构中，嗅觉系统存在广泛的神经元，NCAM2在发育和成熟的嗅上皮中差异表达，发育中的嗅觉系统，嗅上皮的2，3和4区域以及犁鼻上皮的顶端区域中存在表达NCAM2的感觉神经元的轴突，其与腹侧处的NCAM2阴性二尖瓣/簇状细胞形成突触，而NCAM2在突触中累积[18]，由已经在E14的未成熟的二尖瓣/簇状细胞瞬时表达;而在成人的嗅觉系统中，NCAM2不在二尖瓣/簇状细胞的树突中表达，提示NCAM2可能影响突触成熟。Treloar等提出，NCAM2在二尖瓣/簇状细胞树突中的局限表达促进了发育中大鼠的嗅球形成过程，并且指定嗅球在空间上的区域[19]。

2.2 NCAM2表达的基因控制

Nelson等运用信息学的方法在染色体21和22上搜索种间同源区域内STAT5的结合位点簇，鉴定出在NCAM2的调节序列中的第一个内含子区域存在串联STAT5结合位点，激活态的STAT4和STAT5自发地聚集到NCAM2的调节区，相反，STAT1和STAT3并不结合该区域，因此得出结论：转录因子STAT4和STAT5參与调节NCAM2的表达，而STAT1和STAT3无此功能[20]。在人类NK细胞系中，白细胞介素2中NCAM2的表达由激活STAT5的细胞因子诱导，是已知的信号转导过程中STAT5依赖性信号通路之一。Alenius等培养了过表达GPI锚定的NCAM2或跨膜NCAM2的转基因小鼠，证明在NCAM2基因的3′端非编码区中有控制其转录稳定性的元件，导致编码GPI锚定的NCAM2的mRNA没有编码跨膜NCAM2的mRNA稳定[21]，这一结果与GPI锚定的NCAM2特异性的表型比跨膜NCAM2更受限制的表达模式这一事实一致。

3 生物学功能

3.1 NCAM2对神经发育的作用

Ichinohe等在成年大鼠的粒状后躯干皮层中研究了树突束的发育过程，描述了NCAM2免疫反应区域的形状，由于该区域出现的时间及独特的与树突束互补的定位，猜测NCAM2能有效维持和促进树突状区域的形成[22]。但近年来，有研究证明NCAM2表达水平上升导致树突突起不稳定，且皮层神经元中突起向树突棘的转化也减少，NCAM2高表达的神经元聚集在未成熟突触的蛋白质标记物中。体外生长试验中，表达NCAM2的嗅上皮外植体比不表达的个体表现出轴突的生长和束缚增加，表明NCAM2在原发性轴突生长束缚中起作用[23]。综上，提示NCAM2能有效神经突生长与束缚，但不参与突触的形成过程，并且抑制其成熟，一定程度上影响突触的可塑性[24]。

NCAM2与嗅觉系统中轴突和树突的组织有密切关系[25]，对于轴突和树突区室化的形成和维持也十分重要，同时，已经有报道提出了在粒状的后躯皮层中表达的NCAM2也具有类似的作用。野生型和NCAM2敲除小鼠的电生理学试验证明后者的神经活动同步性明显降低，提示NCAM2敲除的嗅觉系统确实有功能性的改变。同时，研究证明NCAM2通过诱导Ca2+内流和CAMKⅡ活化以促进丝状伪足和神经突分支的形成[26]。

3.2 NCAM2在肿瘤治疗中的研究

癌症患者病症的严重程度以及治疗效果的指标在于肿瘤细胞转移的发生与否，NCAM2在某些癌症中过度表达，是一个很好的基因治疗靶点。通过对前列腺癌的27种潜在新标志的转录水平的研究，包括NCAM2的内含子（POP5），结果表明，POP5可用于前列腺癌的诊断和预后[27]。为研究HER2阳性乳腺癌治疗药物曲妥珠单抗的效率问题，利用mRNA分析揭示了54个差异表达的候选基因，其中NCAM2在曲妥珠单抗治疗组中显著低于未治疗的人乳腺导管癌细胞系（BT474细胞系）[28]，提示NCAM2可以作为乳腺癌治疗的基因靶点。并且有研究证明，NCAM2是抗体介导的腺病毒载体递送用于前列腺和乳腺癌细胞感染的有用靶目标。李茂岚等在国内首次通过全基因组测序来研究胆囊肿瘤组织，确定了转移性小细胞胆囊神经内分泌癌（GB-SCNEC）的新型生物标志物，指出NCAM2-SGCZ是胆囊癌变中的变化性因素之一，推测NCAM2在其中起着关键性作用，对胆囊癌淋巴转移的治疗有重大意义[29]。

3.3 NCAM2在动物育种中的研究

脑垂体是控制生长和发育的关键器官，为了解垂体中起作用的分子机制和控制生长的关键基因及NCAM2在其中的作用，通过分析文山黄牛和西门塔尔肉牛2个牛品种脑垂体的转录谱组，发现细胞黏附因子可以通过细胞-细胞接触调节垂体激素分泌，间接影响垂体基本功能，而是NCAM2脑垂体分泌途径中关键基因的候选者之一，提示NCAM2在控制生长发育过程中具有一定的调节作用。NCAM家族的分子多样性于很早以前在斑马鱼中得到验证，前体分子的PCR结果表明NCAM2首次出现在前脑的特定次级神经元簇中，提示NCAM2在斑马鱼神经系统中功能性神经网络的形成和维持中具有重大意义[30]。近年来针对NCAM2在动物育种中的研究较少，但作为一个重要的神经分子，对它的进一步了解有利于解决遗传育种中的难题。

3.4 NCAM2在唐氏综合征中的研究

研究表明，唐氏综合征（Downs syndrome，DS）患者的肺和心脏培养物的成纤维细胞比正常对照组聚集得更快，表明细胞之间黏附性增加，这种21三体的成纤维细胞黏附值上升可能是细胞表面大分子数量增加，而这与人NCAM2被认为是剂量平衡的致病物的说法一致，表明由于21号染色体三体性导致的NCAM2表达增加与唐氏综合征有密切关系。21q22上约4Mb的区域被称为唐氏综合征临界区（Down syndrome critical region，DSCR），研究表明，该区域的3倍性与唐氏综合征的许多表型相关。虽然NCAM2位于DSCR之外，但已经被提出作为唐氏综合征发展的候选基因之一[31]。21三体个体中，NCAM2的三拷贝性可能对形态发生和其他生物学现象也有相当大的影响。

3.5 NCAM2的其他功能

基于全基因組关联研究（GWAS-NR），NCAM2已被提议作为自闭症的候选基因，研究表明，涉及和指导神经突生长的大部分基因都与自闭症有关[32]。Scholz等报道了一位自闭症男孩，他带有一个复杂的染色体重排和21q21缺失，导致NCAM2缺失[33-34]，提示该基因在神经发育中起到关键性作用。

关于阿尔兹海默症（Alzheimers disease，AD）的发病原理现在仍然知之甚少，Leshchynska等提出突触丧失是目前比较认可的发病原因之一，人海马体突触中富含NCAM2，但这种富集在AD患者的海马体中被携带的致病性人淀粉样蛋白-β（Aβ）消除，Aβ与体外培养的海马神经元细胞表面的NCAM2结合，导致NCAM2从突触中消除，解除富集，正是海马体中Aβ诱导的NCAM2丢失引发突触丧失，从而致病[35]。

近年来，研究证明NCAM2还与自杀及哮喘有关，Darlington等通过收集3 000多份自杀死者的DNA样本发现，与之密切相关基因包括与神经发育及神经信号相关的NCAM2[36]。NCAM2介导的嗜同性相互作用在免疫应答相关的细胞识别过程中可能有重要作用。

4 结论

NCAM2已成为一个相当重要的神经分子，并呈现出多元化的发展前景，其在控制神经突向外生长及束缚、突触成熟、神经区室化等方面有重要作用，但还有很多问题值得探讨，需要进一步完善：（1）NCAM2基因结构的基础研究有待进一步被发现，例如胞外域的Ig和FnⅢ区域的灵活性与构象改变及功能适应之间的关系尚未清楚;（2）区域接头的灵活性与NCAM2同型表现出来的不同功能是否有关;（3）NCAM2可以通过FGFR刺激信号转导，但其是否通过FGFR或其他生长因子受体发出信号还有待确定。

近年来，已经有报道证明NCAM2在多种神经退行性疾病如阿尔兹海默病的形成过程及肿瘤迁移中差异表达，提示NCAM2可以作为重要的基因治疗靶点、检测及预后指标，通过对它的进一步研究可对当前癌细胞的高侵袭高增殖这样一个临床上尚未攻克的难题的解决有重要意义;同时，作为控制牛生长发育过程中的重要调节因子，NCAM2作用机制的深入研究与解决动物生长发育缓慢及神经发育异常等疾病有密切关系，有望推动畜牧生产的快速发展，当然在其他未知领域也可能有一定作用。但国内外关于其的研究甚少，就目前来看，NCAM2基因的临床作用仍需要时间和实践的检验，这将是一项巨大的挑战。

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收稿日期：2019-08-26

基金項目：国家自然科学基金青年科学基金（编号：31601926）;贵州省铜仁市科技计划（编号：铜仁科研[2016]18号-5）;贵州省普通高等学校科技拔尖人才支持计划（编号：黔教合KY字2017-089）;贵州省科技计划（编号：黔科合支撑2018-1161、2018-2277）;河南省农业科学院自主创新专项基金（编号：2019ZC41）;河南省农业科学院科研发展专项资金（编号：2019CY08）;国家肉牛牦牛产业技术体系专项（编号：CARS-37）。

作者简介：徐子洁（1999—），女，苗族，贵州铜仁人，主要从事动物遗传与育种研究。E-mail：xzjsci@126.com。

通信作者：黄永震，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为动物遗传与育种研究。E-mail：hyzsci@nwafu.edu.cn。