芍药苷抑制PI3K/AKT信号促进细胞自噬治疗骨关节炎

姚 旭，王清华，茹 艺，高之苑

（辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110847）

骨关节炎是一种临床常见的慢性退行性骨关节疾病，多见于髋、膝、手指关节。临床上多以疼痛为首要表现，晚期多见关节畸形及功能障碍，治疗上仍以对症治疗为主。骨关节炎多见于中老年人，发病率逐年增加[1-3]。随着对骨关节炎的研究越来越多，发现细胞自噬对骨关节炎的发病具有重要作用，但是具体机制仍不明。本研究以软骨细胞自噬为出发点，通过芍药苷的干预，研究芍药苷对骨关节炎细胞自噬的影响，揭示芍药苷治疗骨关节炎的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 细胞：人正常软骨细胞C28/I2，购买于美国ATCC细胞库。主要试剂及药品：芍药苷（索莱宝，货号：SP8030），TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），抗LC3 Ⅰ/Ⅱ抗体及抗Beclin 1抗体（Cell Signaling），抗p-PI3K抗体（Santa Cruz），抗p-AKT抗体（Proteintech）。主要仪器：细胞培养箱，伯乐电泳转印系统，酶标仪，ECL显影仪，细胞 超净台等。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 C28/I2软骨细胞采用DMEM培养基进行培养。待细胞长至培养皿的90%左右时，用胰酶进行消化，传代培养。每2～3 d换1次培养液。

1.2.2 芍药苷对C28/I2活性的影响 对C28/I2细胞进行计数。实验分组为空白对照组、不同浓度芍药苷组，按分组分别加入不同浓度芍药苷，空白对照组不加。加入CCK-8试剂，用酶标仪，取450 nm波长测定各组细胞的吸光度，观察芍药苷对C28/I2软骨细 胞生长的影响。

1.2.3 芍药苷对IL-1β 处理的软骨细胞炎症的影响 C28/I 2细胞分组：对照组、模型组、芍药苷治疗组、芍药苷加3MA组。细胞贴壁生长24 h。按实验分组分别加入试剂及药品，24 h后收集细胞及细胞上清液，提取细胞总蛋白，进行western blot实 验。

1.2.4 western blot对细胞总蛋白进行BCA蛋白定量，进行蛋白变性，经SDS-PAGE电泳凝胶电泳、转膜、封闭。一抗孵育，4 ℃冰箱过夜。二抗室温孵育1 h后，对含有蛋白条带的PVDF膜进行ECL化学发光，并对发光结果进行统计分析。

1.2.5 细胞免疫荧光实验 细胞接种在无菌的细胞爬片上，加药处理后，用4 %多聚甲醛溶液固定，经Triton X-100通透，胎牛血清封闭后，经稀释的一抗于湿盒中，4 ℃孵育过夜。用荧光标记的特异性二抗孵育，封片。待晾干后，在暗室中进行拍照。

1.2.6 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α 和IL-6含量 实验过程按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析。统计结果采用均数±标准差（）表示，2组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 芍药苷对C28/I2软骨细胞活性的影响 采用CCK-8法对不同浓度的芍药苷对软骨C28/I2细胞活力的影响进行检测。结果显示，与正常培养的软骨细胞相比，芍药苷小于25 μmol/L时，对细胞生长没有影响；超过25 μmol/L时，细胞活性呈现下降趋势。因此，25 μmol/L的芍药苷为下一步实验用药浓度。

2.2 芍药苷对IL-1β 引起的C28/I2软骨细胞炎症中自噬蛋白LC3和Beclin 1的影响 结果显示，与对照组相比，模型组 细胞经过IL-1β 处理后，细胞LC3 Ⅱ和Beclin 1蛋白明显减低，表明炎症时细胞的自噬能力降低；与模型组相比，IL-1β 处理后的细胞经芍药苷治疗后，细胞LC3 Ⅱ和Beclin 1蛋白明显增加，表明细胞自噬能力恢复（见图1，表1）。

图1 芍药苷对软骨细胞自噬功能的影响

表1 LC3 Ⅱ和Beclin 1蛋白分析统计结果（）

表1 LC3 Ⅱ和Beclin 1蛋白分析统计结果（）

注：实验重复3次。与对照组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，# P ＜0.05

2.3 芍药苷对IL-1β 引起的C28/I2软骨细胞炎症中PI3K/AKT信号蛋白的影响 实验结果显示：与对照组相比，模型组细胞经过IL-1β 处理后，细胞p-PI3K和p-AKT蛋白明显增加；与模型组相比，IL-1β 处理后的细胞经芍药苷治疗后，p-PI3K和p-AKT蛋白明显降低；当芍药苷与3MA同时应用，抑制了p-PI3K和p-AKT蛋白降低程度（见图2，表2）。

图2 芍药苷对软骨细胞PI3K/AKT信号蛋白影响

表2 p-PI3K和p-AKT蛋白分析统计结果（）

表2 p-PI3K和p-AKT蛋白分析统计结果（）

注：实验重复3次。与对照组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，# P ＜0.05

2.4 芍药苷对IL-1β 引起的C28/I2软骨细胞炎症细胞上清液中TNF-α 和IL-6浓度的影响 与对照组相比，模型组细胞经过IL-1β 处理后，细胞上清液中TNF-α和IL-6质量浓度明显增加；与模型组相比，IL-1β 处理后的细胞经芍药苷治疗后，TNF-α 和IL-6质量浓度明显降低；当芍药苷与3MA同时应用，减弱了TNF-α和IL-6质量浓度降低程度。见表3。

表3 芍药苷对软骨细胞上清液中TNF-α 和IL-6质量浓度的影响（）

表3 芍药苷对软骨细胞上清液中TNF-α 和IL-6质量浓度的影响（）

注：与对照组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01

3 讨论

关节软骨细胞病变是骨关节炎发生发展的关键环节，主要表现为软骨细胞损伤与凋亡[4]。自噬是细胞的一种自我保护机制，在细胞生命周期中发挥重要的生理功能。骨关节炎发生过程中，细胞自噬能力降低，细胞清除自身衰老、受损及炎症细胞内容物的能力下降，导致细胞炎症发展，出现软骨细胞的受损及凋亡[5]。因此，恢复细胞自噬，增加自我修复的能力，可能是治疗骨关节炎的重要手段。

芍药苷是中药芍药的主要药效成分，研究发现其具有抗炎抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁和免疫调节等药理作用[6-9]。研究发现芍药苷能减少IL-1β 处理的大鼠软骨细胞中MMP的表达，抑制软骨细胞中NF-κB的激活，减少软骨细胞凋亡[10-11]。本研究发现，由IL-1β 处理软骨细胞，诱导软骨炎症发生时，细胞内的自噬标志性蛋白LC3 Ⅱ和Beclin 1表达下降，与之前的研究一致[12]。经过芍药苷处理后，LC3 Ⅱ蛋白和Beclin 1蛋白表达增加，表明芍药苷能够增加关节炎时软骨细胞的自噬能力，减少细胞损伤。同时结果还提示，芍药苷可降低炎症时TNF-α 和IL-6等炎症细胞因子。

PI3K/AKT能够调节众多细胞内信号级联的激活，及多种炎症介质功能的发挥[13-14]。骨关节炎发病中，抑制PI3K/AKT轴能够防止关节炎软骨细胞的炎症反应、骨变性异常形成和软骨细胞的衰老[15-16]。研究表明，PI3K/AKT信号通路对于细胞自噬发生起到重要作用[17]。有关骨关节炎的研究[18-19]发现，炎症可抑制大鼠软骨细胞的增殖和细胞周期，降低自噬率。抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路可促进骨性关节炎大鼠关节软骨细胞自噬，减轻炎症反应[20]。本研究发现：IL-1β诱导的软骨细胞炎症时，PI3K/AKT信号被激活，促进炎症的发展，与上述研究结果一致；经过芍药苷干预治疗后，p-PI3K和p-AKT蛋白表达减低。应用自噬抑制剂3MA后，部分拮抗p-PI3K和p-AKT蛋白的减少。这些结果表明，芍药苷可通过抑制PI3K/AKT信号促进细胞自噬活力，减轻炎症反应，减少软骨细胞的损伤，提示芍药苷可能是治疗骨关节炎的有效药物。