新疆芍药的显微鉴定、总多酚含量测定及其对变异链球菌的体外抑菌活性

张浩科，高 静，宫海燕

(1.新疆医科大学第五附属医院检验科，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆 乌鲁木齐 830011；3.新疆塔城市人民医院药剂科，新疆 塔城 834700)

新疆芍药(PaeoniasinjiangensisK.Y.Pan)为毛茛科芍药属多年生草本植物的干燥纺锤状块根[1]，味苦，性微寒，归肝经，具有清热凉血、散淤止痛的功效[2]，主治月经不调等，是妇科疾病的常用药物。新疆芍药主产于新疆阿勒泰地区山坡及披针叶林下或林间灌丛，维吾尔药名为“克孜力出胡鲁克”，与赤芍同科同属，药材名亦称作赤芍，分布较广，是许多中药成方制剂的重要组成药味[3]。新疆芍药的主要化学成分为芍药苷[4]、白芍苷、芍药新苷等，但其总多酚成分鲜有报道。新疆芍药在新疆大量种植与收购，其所含的总多酚成分是一类广泛存在于植物体内的多元酚类化合物，具有抗氧化、抗衰老[5-8]、抑菌[9]、降脂[10-11]等作用及较强的免疫调节活性，可作为新的抑制脂质过氧化、清除自由基的产品，具有进一步开发利用的价值和广阔的应用前景，尤其是在癌症、心血管疾病的治疗方面具有较大的潜力。

变异链球菌(Streptococcusmutans)是龋齿公认的主要致龋菌，龋齿发病率高，分布广，是口腔主要的常见病，也是人类最普遍的疾病之一，世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。

新疆芍药在中医临床治疗中有着广阔的应用前景，随着研究的深入，新疆芍药在医学、食品等行业具有越来越重要的作用。新疆芍药研究目前主要集中于对芍药苷等化学成分的检测，前期研究[12]发现，新疆芍药总多酚对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌均具有一定的体外抑菌活性，但关于新疆芍药总多酚的含量检测及其对变异链球菌的体外抑菌活性尚未见报道。

作者在此对新疆芍药的显微特征进行鉴定，建立新疆芍药总多酚的含量测定方法，评价新疆芍药总多酚对变异链球菌的体外抑菌活性，为有效开发利用新疆芍药资源、初步筛选安全有效的防龋药物和研究新疆芍药总多酚的抑菌作用提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

新疆芍药(PaeoniasinjiangensisK.Y.Pan)，采自新疆阿勒泰地区，经新疆医科大学附属中医院主任药师李永和鉴定，存于新疆医科大学中药民族药标本馆(标本号2010-356)。

没食子酸对照品(批号110831-200302)，中国食品药品检定研究院；福林试剂，天津光复精细化工研究所；碳酸钠，分析纯；实验用水为蒸馏水。

显微镜，Carl Zeiss MicroImaging GmbH；数码显微摄像仪(Motic Image Advanced 3.2,Motican 2306)；AL-204型电子天平(0.1 mg)，梅特勒-托利多仪器有限公司；SK3300LH型超声波发生器，上海科导超声仪器有限公司；GBC DBUV-Cintra 40型紫外可见分光光度计；TDL-40B型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 菌种与培养基

变异链球菌(Streptococcusmutans)由美国典型物种保藏中心提供。

脑心浸液肉汤(BHI)培养基，美国BD公司；琼脂(MH)培养基，英国Oxoid公司。

1.3 新疆芍药的显微鉴定

参照文献[12]配制水合氯醛和稀甘油：称取水合氯醛50 g，加入蒸馏水15 mL、甘油10 mL，混匀溶解，即得水合氯醛；取甘油33 mL，加蒸馏水稀释至100 mL，加液化苯酚1滴，即得稀甘油。

用解剖针挑取新疆芍药粉末适量，置于载玻片中央；滴加水合氯醛1～3滴，用解剖针搅拌均匀，置于酒精灯上加热搅拌至凝固；冷却后，滴加稀甘油1～2滴，盖上盖玻片，用吸水纸吸取边缘多余液体及粉末，置于显微镜下观察。

1.4 新疆芍药总多酚的提取

将新疆芍药粉碎，过60目筛；称取10.0 g置于锥形瓶中，加入100 mL 80%乙醇，浸泡1 h；超声(45 ℃，80 Hz)提取45 min，离心，过滤，即得新疆芍药总多酚提取液。

1.5 新疆芍药总多酚含量的测定

1.5.1 没食子酸对照储备液的制备

精密称取没食子酸对照品5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入蒸馏水溶解，定容至刻度，即得0.1 mg·mL-1没食子酸对照储备液。

1.5.2 样品溶液的制备

取60 mL新疆芍药总多酚提取液，加入80%乙醇定容至100 mL，即得样品溶液。

1.5.3 标准曲线的绘制

精确量取没食子酸对照储备液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL，分别置于10 mL容量瓶中；各加6 mL蒸馏水、0.5 mL福林试剂，充分摇匀；1 min后加入1.5 mL 20%Na2CO3溶液，用蒸馏水定容；于75 ℃水浴反应10 min，用紫外可见分光光度计测定760 nm处吸光度。以没食子酸浓度(c，mg·mL-1)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程。

1.5.4 样品测定

精确量取100 μL样品溶液，加入6 mL蒸馏水、0.5 mL福林试剂、1.5 mL 20%Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至10 mL，75 ℃水浴10 min，冷却后测定760 nm处吸光度，平行测定3次，依据线性回归方程计算新疆芍药总多酚含量。

1.6 新疆芍药总多酚对变异链球菌的体外抑菌活性评价

药液的制备：将新疆芍药总多酚提取液经冷冻干燥后，得干燥粉末，用无菌生理盐水溶解，并过0.22 μm滤膜，稀释成5个不同的浓度：144.48 mg·mL-1、72.24 mg·mL-1、36.12 mg·mL-1、18.06 mg·mL-1、9.03 mg·mL-1。

菌液的制备：将保藏的变异链球菌菌种从-80 ℃冰箱中取出，复苏传代，孵育18～24 h；取单个菌落接种于BHI培养基中，在37 ℃、5%CO2条件下培养18～24 h；用无菌生理盐水将菌液调至1×105CFU·mL-1。

按菌液与药液体积比1∶10，将菌液分别加到不同浓度的总多酚溶液中，于37 ℃、5%CO2条件下培养18～24 h，应用平板菌落计数法计算平均菌落数，分析新疆芍药总多酚对变异链球菌的体外抑菌活性。以氨苄西林溶液作为对照，每个浓度设3个平行。

2 结果与讨论

2.1 新疆芍药的显微特征

利用显微成像技术和显微鉴定法，对新疆芍药粉末进行显微鉴定。从粉末制片中可观察到纤维、非腺毛、螺纹导管、气孔、栅栏细胞，如图1所示。

图1 新疆芍药粉末的显微鉴定

2.2 新疆芍药总多酚的含量

以没食子酸浓度(c，mg·mL-1)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。

图2 没食子酸标准曲线

对标准曲线进行拟合，得线性回归方程y=137.25x+0.09221(R2=0.999)，线性范围为0.001～0.005 mg·mL-1，即没食子酸浓度在0.001～0.005 mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

取新疆芍药总多酚提取液按1.5.2制备样品溶液，测定760 nm处吸光度，依据线性回归方程计算新疆芍药总多酚含量为(9.58±1.03)mg·g-1。

2.3 方法学考察

(1)稳定性：取样品溶液，分别于0 min、10 min、20 min、40 min、80 min、160 min按1.5.4方法测定总多酚含量。计算RSD为0.96%(n=6)，表明样品在160 min内稳定性良好。

(2)精密度：取样品溶液按1.5.4方法测定总多酚含量，重复测定5次。计算RSD为0.23%(n=5)，表明该方法精密度良好。

(3)重复性：取样品溶液5份，按1.5.4方法测定总多酚含量。计算RSD为1.1%(n=5)，表明该方法具有较好的重复性。

(4)加标回收率：精密称取6份已知含量的新疆芍药粉末5.0 g，分别精密加入没食子酸200 mg，置于250 mL具塞锥形瓶中，按1.5.4方法测定总多酚含量，结果见表1。

表1 加标回收率实验结果

由表1可知，加标回收率为96.83%～103.07%，平均值为99.84%，RSD为2.27%，表明该方法准确性较好。

2.4 新疆芍药总多酚对变异链球菌的体外抑菌活性

抑菌实验结果表明，新疆芍药总多酚对变异链球菌具有一定的体外抑菌活性，最低抑菌浓度(MIC)为72.24 mg·mL-1，在配制的浓度范围(144.48 mg·mL-1、72.24 mg·mL-1、36.12 mg·mL-1、18.06 mg·mL-1、9.03 mg·mL-1)内未检测出新疆芍药总多酚对变异链球菌的最低杀菌浓度(MBC)。对照组氨苄西林对变异链球菌的MIC为60 μg·mL-1、MBC为120 μg·mL-1。

3 结论

对新疆芍药粉末进行了显微鉴定，为药材的推广应用和鉴定奠定了基础。采用超声法提取新疆芍药总多酚，应用Folin-Ciocalteu比色法测定总多酚的含量，方法操作简单，具有较好的重复性和稳定性，可作为新疆芍药质控的参考方法，为新疆芍药的进一步开发利用提供了依据。新疆芍药总多酚的体外抑菌实验结果表明，其对变异链球菌具有一定的体外抑菌活性。针对龋齿治疗药物的局限性，新疆芍药总多酚作为潜在的抑菌成分，其抑菌机制有待于进一步研究与探索。