miRNA-214靶向作用于钙网蛋白保护阿霉素相关大鼠心肌损伤

马芸芸 李 礼 赵 琳

（宁夏医科大学总医院心内科，银川 750001）

阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用[1-2]。在毒性作用试验中，阿霉素具有显著的心肌毒性，可导致不可逆转的心肌损伤，最终发展为扩张型心肌病或充血性心力衰竭[3-4]。miRNA-214是近年来发现的一类对恶性肿瘤发生发展具有重要作用的微小RNA，在心肌细胞的相关研究中，miRNA-214的表达同样丰富[5-6]。但目前关于miRNA-214对阿霉素心肌损伤的相关研究较少。因此，本研究探讨miRNA-214对阿霉素相关心肌损伤的保护作用及相关机制，以期为临床提供新的靶向治疗方向。

1 材料和方法

1.1 动物与试剂

6～8周SPF级SD大鼠30只，体质量（240±20） g，购于第三军医大学第三附属医院野战外科研究所，动物合格证号：0001517。钙网蛋白抗体购于上海顺博生物工程有限公司；荧光定量PCR试剂盒、逆转录试剂盒、总RNA提取试剂盒均购于武汉博士德生物科技有限公司。

1.2 携带miRNA-214的腺相关病毒构建

构建中间载体质粒pGenesil-12-pre-miRNA-214，限制性酶切位点后的片段中包含miRNA-214和miR-miRNA-214，构建腺相关病毒质粒 pAAV-premiRNA-214，将质粒导入AAV-293细胞，产生含目的基因miRNA-214的腺相关病毒。

1.3 模型构建及分组

将30只大鼠随机分为对照组、模型组、miRNA-214转染组，分别采用不同的处理方法。对照组：正常饲养，不采取任何处理。模型组：采用40 mg/kg戊巴比妥钠腹膜内麻醉，将10 mg阿霉素溶解于30 mL生理盐水中，根据1.8 mg/kg剂量标准，隔日尾静脉注射阿霉素，总计给药10次，建立阿霉素心肌损伤模型。 miRNA-214转染组：麻醉后气管插管，连接小型动物呼吸机，造模过程同模型组。向大鼠尾静脉注射0.1 mL miRNA-214-AAV。

1.4 超声心动图检测

大鼠麻醉后，固定，备皮，采用彩色多普勒超声仪对大鼠心功能相关指标进行检测，指标包括左心室收缩末期内径（left ventriular end-systolic diameter，LVSD）、左心室舒张末期内径（left ventriular end-diastolic diameter， LVDD）、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、舒张末期室间隔厚度（interventricular septal thickness， IVST）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 心质量及心肌肥厚指数测定

各组大鼠称质量，麻醉后，取出心置于生理盐水中，冲洗干净，用双侧滤纸吸干水分，用电子天平称量全心质量、左心室和右心室质量。全心肥厚指数=全心质量/体质量；左心室心肌肥厚指数=左心室质量/体质量；右心室心肌肥厚指数=右心室质量/体质量。

1.6 炎症因子及心功能标志物检测

收集各组大鼠静脉血，3 500 r/min离心10 min，收集上清液，采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠炎症因子谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）水平及心功能标志物肌酸激酶（creatine kinase, CK）、B型利钠肽（B type natriuretic peptide, BNP）水平，均严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 心组织形态结构观察

切取各组大鼠左心室前壁危险区心肌组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，梯度乙醇脱水、二甲苯透明。石蜡包埋后切片，进行H-E染色，光学显微镜下观察心肌组织病理形态改变并采集图像。

1.8 PCR检测心肌组织miRNA-214表达水平

参照操作说明书提取总RNA，将细胞RNA反转录成cDNA，然后扩增成DNA。miRNA-214正向引物序列为5'-ACAGCAGGCAC AGAC-3'；反向引物序列为5'-GAGCAGGCTGGAG AA-3'；miRNA-214探 针 引 物 序 列 为5'-FAM+AGG CAGTGCGCGTG-MGB-3'；选取U6作为内参基因。定量实时PCR检测为一式3份进行，包括无模板对照，将miRNA-214的表达标准化为U6。RT-PCR反应条件如下：95℃预变性10 min，然后95℃变性30 s，50℃退火30 s，40个循环，最后70℃延伸10 min结束。实时PCR实验的平均水平使用2-ΔΔCt方法进行微小修正。阈值循环（Ct）定义为荧光通过固定阈值的分数循环数。计算miRNA-214和U6的平 均Ct，将ΔCt确 定 为miRNA-214的 一 式3份Ct的 平 均 值 减 去U6的 一 式3份Ct的 平 均 值，与U6相比，样品的miRNA-214的相对拷贝数表示为2-ΔΔCt。

1.9 免疫印迹检测心肌组织钙网蛋白表达水平

收集各组的大鼠心肌组织，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。混合上样缓冲液，煮沸变性，电泳、转膜、封闭钙网蛋白一抗（工作浓度1∶500）二抗（工作浓度1∶2 500）孵育、ECL法显影定影。通过Quantity One软件分析条带强度，以U6为内参，检测钙网蛋白的表达。

1.10 统计学处理

应用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料采用x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠一般情况及体质量

对照组大鼠一般状况良好，进食饮水正常，无死亡情况发生。模型组大鼠在第4天时，出现明显的精神不佳，进食及活动减少，毛发无光泽；miRNA-214转染组出现不良症状的时间较模型组晚，进食量及饮水量略高于模型组。对照组大鼠体质量一直呈显著的上升趋势，模型组与miRNA-214转染组大鼠体质量呈逐渐下降趋势，但miRNA-214转染组大鼠体质量下降更为缓慢（图1）。

2.2 各组大鼠心质量及肥厚指数比较

第21天处死大鼠，完整取出心及肝。3组大鼠的全心质量、左心室质量、全心肥厚指数、左心室肥厚指数差异均有统计学意义（P＜0.01）。与对照组比较，模型组及miRNA-214转染组全心质量、左心室质量显著降低，全心肥厚指数、左心室肥厚指数均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，miRNA-214转染组全心质量、左心室质量显著升高，全心肥厚指数、左心室肥厚指数均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠心质量及肥厚指数比较（n=10， ±s）Tab 1 Comparison of cardiac mass and hypertrophy index of rats in each group（n=10， ±s）

表1 各组大鼠心质量及肥厚指数比较（n=10， ±s）Tab 1 Comparison of cardiac mass and hypertrophy index of rats in each group（n=10， ±s）

*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model

?

2.3 各组大鼠心组织病理改变比较

对照组心肌组织结构未明显异常，肌纤维完整，横纹排列整齐，肌浆内无空泡变性。与对照组比较，模型组心肌纤维排列紊乱，边界不规则，心肌纤维断裂，细胞水肿，胞质染色变浅，局部有炎细胞浸润。 miRNA-214 转染组心肌纤维破坏程度较模型组显著减轻，肌纤维完整，横纹排列整齐，有少许中性粒细胞浸润，无空泡变性（图2）。

2.4 各组大鼠心肌细胞miRNA-214表达水平比较

与对照组大鼠相比，模型组大鼠心肌细胞中miRNA-214的相对表达量显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，转染组大鼠心肌细胞中miRNA-214相对表达量显著升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.5 各组大鼠炎症因子及心功能指标比较

3组大鼠的心功能相关指标差异均有统计学意义（P＜0.01）。两两比较后显示，模型组的ALT、AST、LDH、CK、BNP水平最高，miRNA-214转染组次之，对照组相关指标均最低，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 3组大鼠心功能指标比较（n=10， ±s）Tab 2 Comparison of heart function indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

表2 3组大鼠心功能指标比较（n=10， ±s）Tab 2 Comparison of heart function indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model

?

2.6 各组大鼠心结构指标比较

3组 大 鼠 的LVSD、LVDD、LVFS、LVPWT、LVEF比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。与对照组比较，模型组及miRNA-214转染组LVSD、LVDD显著升高，LVFS、LVEF显著降低；与模型组比较，miRNA-214转染组LVSD、LVDD显著降低，LVFS、LVEF显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 3组大鼠心结构指标比较（n=10， ±s）Tab 3 Comparison of heart structure indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

表3 3组大鼠心结构指标比较（n=10， ±s）Tab 3 Comparison of heart structure indexes of three groups of rats（n=10， ±s）

*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model

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图1 3组大鼠体质量变化.图2 3组大鼠心肌组织病理改变，标尺=100 μm。A：对照组；B：模型组；C：miRNA-214转染组.图3 3组大鼠心肌细胞miRNA-214表达情况。*P＜ 0.05 vs 对照组；△P＜0.05 vs 模型组.Fig 1 Changes in body mass of three groups of rats.Fig 2 H-E staining diagram of myocardial cells in three groups of rats， bar=100 μm. A：Control group；B：Model group；C：miRNA-214 transfection group.Fig 3 Expression of miRNA-214 in myocardial cells of three groups of rats. *P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs model.

2.7 各组大鼠心肌细胞钙网蛋白表达比较

免疫印迹检测结果显示，与对照组相比，模型组钙网蛋白相对表达量升高；与模型组相比，转染组钙网蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

图4 3组大鼠心肌细胞钙网蛋白表达水平Fig 4 Expression level of calreticulin in cardiomyocytes of three groups of rats

3 讨论

肿瘤化疗药物阿霉素具有明显的心肌毒性并可引起心力衰竭，在不削弱其化疗作用的前提下减轻其心肌毒性是临床热点的研究方向[7]。Gupta等[8]报道在阿霉素诱导的心脏模型中，RNA结合蛋白QKI表达下降，确认OKI提高了心肌细胞对阿霉素的敏感性，而过表达QKI则抑制了阿霉素诱导的心肌凋亡，并证实是通过调控circRNA的表达发挥作用。

本研究对大鼠一般状况及体质量进行动态监测，结果显示对照组大鼠一般状况良好，进食饮水正常，无死亡情况发生。相较于模型组，miRNA-214转染组表现出可有效缓解其不良状态，并且出现不良症状的时间较模型组晚，进食量及饮水量略高于模型组。实时PCR检测结果显示，miRNA-214转染组miRNA-214的表达水平比对照组仅模型组大鼠明显升高。本研究成功使得miRNA-214在小鼠心中过表达，过表达能够诱导小鼠心肌肥厚，并导致心功能受损，这与已有研究结果一致[9-10]。另外，miRNA-214的过度表达可逆转缺陷心室肌细胞的增殖低下，大鼠miRNA-214的靶向缺失会出现异常的心形态。当机体出现心肌损伤状况后，心肌细胞增殖受阻，可能会影响其他miRNA的表达， 从而出现某类型miRNA表达量下降；从另一个角度来说，如果刺激相应类型miRNA的过表达，可能会在一定程度上抑制心肌细胞的增殖[11]。另一方面，本研究通过腺病毒转染技术构建心肌细胞高表达miRNA-214的大鼠模型。通过超声心动图检查显示，模型组大鼠的LVSD、LVDD显著高于对照组及转染组，LVFS、LVEF明显较低，提示大鼠以左心室结构扩张、收缩功能下降为主，表明模型构建初步成功。同时，对大鼠心进行称重后显示，模型组的全心质量、左心室质量最低，全心肥厚指数、左心室肥厚指数最高，miRNA-214转染组次之。出现上述结果可能归因于miRNA-214以组织特异性方式表达，并在组织发育和许多生物过程中起关键作用。miRNA负责细胞表观基因组的改变，能够在转录后调节基因表达。最近研究表明，miRNA和其他表观遗传因子可以相互调节或协同调节几种生物过程[12]。许多实验研究已经证明钙网蛋白可以调节多种类型细胞或疾病状态中的miRNA表达[13]，另一方面，miRNA可以直接靶向表观遗传因子，例如DNA甲基转移酶或钙网蛋白，从而调节染色质结构，并有效调控miRNA与其他表观遗传机制之间的协调行动，以加强miRNA-214基因表达[14]。

钙网蛋白是一种进化上高度保守的多功能蛋白质，蛋白在肿瘤细胞，凋亡的细胞，一些药物处理的细胞（如蒽环类药物）的表面表达量要多于正常的细胞[15]。研究者通过在体实验发现，缺血预处理可增加大鼠心脏梗死边缘区心肌组织钙网蛋白的表达，且其表达量与梗死面积呈负相关[16]。王建礼[17]发现钙网蛋白后处理减轻缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞死亡、LDH漏出和氧化应激程度。本研究免疫印迹检测结果显示，与对照组相比，模型组钙网蛋白的表达量升高；与模型组相比较，转染组中钙网蛋白的蛋白表达量显著减低，表明miRNA-214的过表达下调了钙网蛋白的表达，这可能是miRNA-214发挥心肌保护作用的机制之一，后续工作将探讨其生物学功能及其在心肌损伤保护中的作用机制。

综上所述，本研究结果表明，miRNA-214可通过下调钙网蛋白，缓解心肌损伤，有望成为一个新的治疗靶标。