鱼腥草素对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响

张朋朋 陈勇 郭江福 韩全胜 罗锐

(贵州省人民医院急诊外科，贵州 贵阳 550002)

目前老年骨质疏松尚无理想的根治方法，疾病治疗的主要目标是延缓骨质疏松的发展速度。研究证实，氧化应激生成的活性氧会影响成骨细胞与破骨细胞，将破坏成骨与破骨细胞间的动态平衡，增加骨质疏松风险〔1〕。流行病学研究发现，骨质疏松患者机体抗氧化剂、氧化剂之间存在水平表达不平衡的情况，氧化剂水平明显高于抗氧化剂水平〔2〕。激素替代疗法是目前骨质疏松防治主要手段，但随着激素替代疗法的广泛应用，其带来的危害逐渐显现，研究发现，英国在1993～2003年期间，>50岁女性经激素替代疗法防治骨质疏松导致了至少2万例乳腺癌的发生〔3〕，且该治疗带来的乳腺癌风险在国内也有相关概述〔4〕。可见激素替代应用的安全性有待商榷，还应继续探讨更为安全性的新治疗方法。鱼腥草素主要活性成分鱼腥草素钠化学结构稳定，可以抑制炎症发生，还具有抑制动脉粥样硬化血管中膜增厚等作用〔5〕。本研究探讨鱼腥草素对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响，旨在为骨质疏松的防治提供数据参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 贵州医科大学动物实验中心提供的雄性SD大鼠，体重200 g，日龄均≤3 d。

1.2实验主要试剂 鱼腥草素、Ⅱ型胶原酶、胰酶等均购自北京索莱宝科技；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自四季青生物工程；购自赛业生物科技的成骨诱导分化培养基试剂盒，购自同仁化学研究所的细胞计数试剂盒(CCK)-8；购自南京建成生物的碱性磷酸酶试剂盒。

1.3主要仪器 上海点科学仪器提供pH测定仪(PHS-3C型)，OLYMPUS公司提供生物显微镜(BX51型)、倒置显微镜(IX71型)；北京白洋医疗器械提供医用离心机(BY-320A型)；上海跃进医用光学器械提供恒温水温箱(HH-W21-600BS型)，美国热电公司提供全自动酶标仪(Thermo Multiskan Asccen型)；英国埃尔格公司提供超纯水机(PURLABULTRA型)；美国Thermo公司提供二氧化碳培养箱(371型)，日本Sanyo提供超低温冰箱，梅特勒托利多集团提供酸度计(PHSJ-3F型)、电子天平(AE240型)，Scotsman集团提供制冰机(AF100型)，美国Thwemolyne公司提供旋涡混合器。

1.4获取并培养成骨细胞 麻醉后处死大鼠，无菌取颅骨，彻底剥除骨膜等主要软组织，充分剪碎颅骨，缓冲液冲洗并加入适量的胰蛋白酶，消化后加入培养基(含胎牛血清)消化终止，去除消化液，向内加入胶原酶Ⅱ消化，时间为30 min，将消化液去除；向内再次加入胶原酶Ⅱ消化，时间为60 min，使用15 ml离心管，将消化液移至离心管内，离心处理后丢弃上清液，并向内加入适量胎牛血清，制作细胞悬液，移液器移入细胞悬液至培养瓶，在5%二氧化碳分压、37℃、合理胞核湿度的条件下进行培养。培养期间换液，使用倒置显微镜对细胞生长情况仔细观察。等到整个瓶底铺满细胞后吸出培养液，使用胰蛋白酶消化进行传代培养。使用第三代细胞做实验。使用成骨诱导液将鱼腥草素配置为0、1、10、20、30、40 μmol/L 6种浓度培养液。

1.5CCK-8法测定细胞增殖 使用胰蛋白酶消化后第三代细胞，接种在96孔培养板内，100 μl/孔，分别向孔内加入浓度为0、1、10、20、30、40 μmol/L的鱼腥草素+成骨细胞诱导液，在5%二氧化碳体积分数、37℃的条件下培养，并将未加入鱼腥草素的第三代细胞作为空白对照，分别在第1、4、7、10天向每孔内加入10 μl CCK-8溶液，细胞培养板孵育，酶标仪测定吸光度。

1.6采用茜素红染色法评价矿化结节情况 细胞接种方法不变，培养时间为15 d，参照文献〔6〕中相关方法，使用茜素红染色法评价不同鱼腥草素浓度的矿化能力。2次去培养基磷酸盐缓冲液冲洗，乙醇固定1 h后加入茜素红S 40 mmol/L作用10 min，缓冲液洗涤3次，使用倒置显微镜观察。后向内加入氧化十六烷基吡啶(CPC)孵育，时间为15 min，细胞基质释放染料在562 nm波长下观测吸光度定量。

1.7采用Western印迹法测定碱性磷酸酶(ALP)蛋白水平 以4×104/皿的密度将细胞接种在10 cm培养皿上，第10天时参照文献〔7〕中体积方法提取蛋白。放射免疫沉淀(RIPA)裂解液裂解离心细胞后取上清液得到总蛋白，蛋白浓度试剂盒检测后分离蛋白，采用湿转法转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。封闭加入稀一抗-抗大鼠ALP抗体过夜。洗涤与稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗孵育60 min。再次洗涤，使用化学发光液与伯乐分子影响系统收集图像并仔细分析。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为蛋白表达量内参。使用酶标仪检测520 nm处吸光度，记录数据后根据公式计算ALP蛋白活性。

1.8统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件进行单因素方差分析，LSD-t检验，χ2检验。

2 结 果

2.1细胞形态观察 接种培养细胞4 h后贴壁，形态多为多角形、三角形或纺锤形，经24 h培养后可见细胞数量上升、体积增加、有交联融合发生，如图1；经7 d成骨诱导后，采用茜素红染色发现小钙化结节，如图2。

图1 大鼠干细胞接种培养24 h(×4)

图2 大鼠干细胞成骨诱导培养第7天(茜素红染色，×100)

2.2成骨细胞增殖抑制情况 鱼腥草素作用2、7 d后，空白对照组、1、10、20、30、40 μmol/L组吸光度值随着浓度增加均呈下降趋势，各时点各组吸光度值比较差异有统计学意义(P<0.05)。即随着鱼腥草素浓度升高，成骨细胞增殖抑制作用增强，直至40 μmol/L浓度时成骨细胞增殖抑制作用有所缓解。见表1。

表1 各组体外培养不同时间大鼠成骨细胞增殖抑制作用吸光度值比较

与0 μmol/L比较：1)P<0.05；与1 μmol/L比较:2)P<0.05；与10 μmol/L比较:3)P<0.05；与20 μmol/L比较:4)P<0.05；与30 μmol/L比较:5)P<0.05；表2、3同

2.3矿化结节染色结果 成骨诱导培养7、14 d后，采用茜素红染色结果显示，10、20 μmol/L组矿化结节数多于其他各组，其他各组中40 μmol/L组培养各时点矿化结节数最少，其他浓度组培养7 d时，矿化结节数由少至多依次为空白对照组、1 μmol/L组、30 μmol/L组；培养14 d时依次为空白对照组、30 μmol/L组、1 μmol/L组，各组间矿化结节数比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组培养不同时间矿化结节数比较个/孔，n=16)

2.4ALP活性测定结果 在同一时间点，鱼腥草素浓度为10～20 μmol/L时ALP活性最高，当浓度升高至30～40 μmol/L时有ALP活性抑制出现，随培养时间延长ALP活性促进或抑制情况继续增强，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组培养不同时间ALP活性测定结果比较吸光度/μg)

3 讨 论

体外培养成骨细胞是研究成骨细胞功能与特性的重要工具，但因成骨细胞在矿化后有硬组织包裹，故取材相对困难〔8〕。目前，体外培养成骨细胞的各类技术已经逐渐成熟，包括原代细胞培养、骨组织培养等，其他间质干细胞分离提取诱导的方法也有使用，但这些体外培养成骨细胞的方法均有局限性，如骨细胞数量不够、骨细胞纯度低下、骨细胞活性低下等〔9，10〕。本研究中将大鼠颅骨粉碎并经酶消化，将消化液与未完全消化骨片共同培养，分离提取原代成骨细胞，该体外培养大鼠成骨细胞的方法，较其他成骨细胞提取技术更具优势，其步骤相对简单，培养细胞的活性更强，纯度也更高，用于临床实验研究更具价值〔11〕。

成骨细胞及破骨细胞二者在功能方面存在动态平衡关系，二者之间平衡关系是保证并维持骨组织正常的基础，一旦二者之间的平衡关系被破坏，成骨细胞凋亡速度将明显加快，短时间内成骨细胞数量将大大减少，此时破骨细胞凋亡受抑制，增加骨质疏松风险〔12～14〕。此外，骨质疏松的发展还与机体免疫系统紧密相关，免疫系统受到外界不良刺激后异常激活，免疫系统的异常激活会对成骨细胞及破骨细胞产生影响，使得二者动态平衡打破；此外，免疫系统在发生异常后，还会产生各种细胞因子，这些细胞因子将通过各自对应的信号通路与对应受体相结合，对成骨细胞与破骨细胞之间的平衡产生影响，最终诱发骨质疏松〔15，16〕。目前，可以用于骨质疏松治疗且很好改善患者成骨细胞与破骨细胞平衡的药物并不多见，多数药物的使用仅仅只能延缓患者疾病进程，在治疗上均无法达到预期。故为骨质疏松患者成骨细胞与破骨细胞之间功能不平衡状态找到一个新的治疗靶点与方向一直是临床研究的难点。鱼腥草素又名癸酰乙醛，是三百草科植物蕺菜挥发油主要抗菌成分，是一种具有挥发性气味的芳香油，在临床上多用于免疫系统相关疾病的治疗，对诸多菌种有着理想的抑制作用，可增强机体白细胞吞噬能力，调动机体免疫力〔17〕。朱善元等〔18〕在研究中发现，鱼腥草素的使用能够刺激淋巴细胞增殖能力，对动物免疫功能的影响好。

考虑成骨细胞与破骨细胞间功能不平衡可能与机体免疫系统有关，本研究将不同浓度的鱼腥草素用于体外培养成骨细胞增殖的诱导，结果显示，鱼腥草素可能具有抑制骨吸收、抑制破骨细胞活性增强、抑制成骨细胞凋亡等功效，可以考虑将其作为未来骨质疏松治疗药物研究的新靶点。因本研究只是研究鱼腥草素对成骨细胞功能影响及受体表达具体情况，加之无循证学依据作为理论支持，故还需要继续研究鱼腥草素具体的作用机制及信号通路，其是否对机体骨骼系统有影响还需要进一步行体内实验。