PD-L1、HBME-1在甲状腺乳头状癌组织中的表达及临床意义

周 翼，吴林军，雷建东

(四川省乐山市中医医院检验科，四川乐山 614000)

甲状腺癌可发生于任何年龄段，高发于中青年女性。甲状腺癌初期可在甲状腺内局限生长数年，可经淋巴管扩散至其他组织，其发病受激素、遗传易感、环境等因素影响，缺碘、放射性物质照射、电离辐射过度、甲状腺炎均可引起甲状腺肿瘤[1]。患者常表现为颈部无痛性肿块，少数患者会有吞咽困难症状。甲状腺癌按照病理组织分型分为乳头状癌、髓样癌、滤泡癌、低分化癌、未分化癌、鳞状细胞癌，甲状腺乳头状癌是甲状腺癌中最常见的类型[2]。近年来，通过检测各种生物标记物在肿瘤中的表达从而辅助诊断肿瘤已成为临床研究热点。人骨髓内皮细胞标记物-1(HBME-1)是内皮细胞微绒毛表面的一种抗原，在肿瘤血管形成及生长过程中发挥重要作用[3]。有研究发现，HBME-1在恶性间质肿瘤中高表达[4]，推测HBME-1可在临床辅助诊断甲状腺乳头状癌时发挥重要作用。程序性死亡因子配体-1(PD-L1)是程序性死亡因子的配体，已被多项研究证实存在于多种恶性肿瘤中。有研究报道PD-L1在肺癌细胞的免疫逃逸机制中发挥重要作用，它可通过与程序性死亡因子结合，促进T细胞凋亡，从而使肺癌细胞不被杀伤[5]。但目前，对PD-L1在甲状腺乳头状癌中表达情况的研究较少。本研究通过检测甲状腺乳头状癌中HBME-1及PD-L1表达情况，探究两种指标对评估肿瘤进展情况的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年4月至2019年5月本院收治的甲状腺乳头状癌患者102例为研究对象。纳入标准：(1)符合甲状腺癌诊断标准[6]，经病理组织学检查诊断为乳头状癌；(2)接受甲状腺乳头状癌肿瘤切除手术；(3)年龄18～65岁。排除标准：(1)良性甲状腺肿瘤；(2)合并其他恶性肿瘤；(3)合并免疫系统疾病；(4)合并感染性疾病；(5)哺乳期及妊娠期女性。通过手术切除患者病灶组织及癌旁甲状腺正常组织，分别作为观察组与对照组。本研究纳入患者年龄26～65岁，平均(42.62±5.37)岁；男57例，女45例；已发生淋巴结转移37例，未发生淋巴结转移65例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期37例。本研究获得本院医学伦理委员会批准，所有患者及家属对本研究内容充分知晓，自愿签署知情同意书。

1.2方法 对两组甲状腺组织进行免疫组化染色，免疫组化染色原理：以携带显色剂的特异性抗体与抗原结合为理论基础，观察抗原抗体反应复合物在细胞中的呈色反应，对相应蛋白进行定性及定量分析[7-9]。方法：(1)将两组病理组织进行常规石蜡包埋、切片、脱蜡、水化(同一患者制作两张病理切片)，使用磷酸盐缓冲液(PBS，上海莼试生物技术有限公司，货号：CS-0779S)冲洗3次，每次2 min；(2)向切片中滴加3%过氧化氢溶液50 μL，室温下放置10 min后使用PBS冲洗3次，每次2 min；(3)向切片中滴加50 μL山羊血清封闭液(爱必信上海生物科技有限公司，货号：abs933)，室温孵育30 min，使用PBS冲洗3次，每次2 min；(4)向切片中分别滴加PD-L1抗体(上海沪震实业有限公司，货号：1234-00-00)、HBME-1抗体[艾博抗(上海)贸易有限公司]，4 ℃冰箱孵育一夜后使用PBS冲洗3 min；(5)向切片中滴加50 μL酶标鼠抗兔复合物，室温孵育30 min，PBS冲洗3次，每次2 min；(6)向切片中滴加2滴DAB溶液(合肥康源生物科技有限公司，货号：DAB002)染色，同时使用显微镜观察，当镜下观察到棕色时终止染色，自来水冲洗1 min；(7)向切片中滴加苏木素染液(上海源叶生物科技有限公司，货号:R20568-100 mL)复染30 min，自来水冲洗2 min；(8)使用85%、95%、100%梯度酒精分别脱水5 min，二甲苯透明5 min，中性树脂封片，贴标签后显微镜观察染色情况。阴性对照使用PBS代替酶标鼠抗兔复合物。

阳性结果判断：HBME-1定位于细胞膜，观察到细胞膜为棕黄色或棕褐色即为阳性，PD-L1定位于细胞膜或细胞质，观察到细胞膜或细胞质为棕黄色或棕褐色即为阳性。每张切片选取5个高倍镜视野，人工计数每个视野中阳性细胞数目，统计平均阳性细胞数。染色强度评分标准：无任何着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞数评分标准：阳性细胞数<总细胞数的30%为1分，阳性细胞数>总细胞数的30%为2分。染色强度评分×阳性细胞数评分为0～<2分表示阴性，2～<4分表示弱阳性、4～6分表示强阳性[10]。阳性率=(弱阳性例数+强阳性例数)/总例数×100%。

1.3观察指标 (1)观察组与对照组中PD-L1的免疫组化结果；(2)观察组与对照组中HBME-1免疫组化结果；(3)PD-L1与HBME-1表达情况与甲状腺乳头状癌一般特征的单因素分析，纳入研究的因素包括年龄是否大于或等于45岁、性别、病灶大小、有无淋巴结转移、肿瘤数量、是否侵犯包膜；(4)PD-L1、HBME-1表达情况与甲状腺乳头状癌一般特征的多因素分析。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据处理及统计分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用配对χ2检验；多因素分析采用Logistic回归分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组PD-L1免疫组化结果比较 PD-L1在观察组中阳性率为69.61%(71/102)，明显高于对照组的15.69%(16/102)，差异有统计学意义(χ2=60.625，P<0.001)，见表1。观察组PD-L1阳性细胞也较多，对照组几乎无PD-L1阳性细胞，见图1。

表1 两组PD-L1免疫组化结果比较

2.2两组HBME-1免疫组化结果比较 HBME-1在观察组中阳性率为73.53%(75/102)，明显高于对照组的6.86%(7/102)，差异有统计学意义(χ2=94.291，P<0.001)，见表2。免疫组化结果显示观察组HBME-1阳性细胞较多，对照组几乎无HBME-1阳性细胞，见图1。

2.3PD-L1及HBME-1表达情况与甲状腺乳头状癌一般特征的单因素分析 有淋巴结转移、侵犯包膜患者PD-L1阳性率明显高于无淋巴结转移、侵犯包膜患者，差异有统计学意义(P<0.05)；有淋巴结转移、侵犯包膜患者HBME-1阳性率明显高于无淋巴结转移、侵犯包膜患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4PD-L1及HBME-1表达情况与甲状腺乳头状癌影响因素的多因素分析 将单因素分析中差异有统计学意义(P<0.05)的因素纳入多因素分析，结果显示，PD-L1、HBME-1表达阳性均是淋巴结转移及侵犯包膜的高危因素(P<0.05)，即PD-L1、HBME-1表达阳性率越高，患者肿瘤组织发生淋巴结转移、侵犯包膜的风险越大，见表4。

表2 两组HBME-1免疫组化结果比较

注：A为免疫组化染色阴性对照，无任何着色(×200)；B为HBME-1染色阳性细胞(×200)；C为HBME-1染色阴性细胞(×200)；D为PD-L1染色阳性细胞(×200)；E为PD-L1染色阴性细胞，几乎无着色(×200)。

表3 PD-L1及HBME-1表达情况与甲状腺乳头状癌影响因素的单因素分析[n(%)]

续表3 PD-L1及HBME-1表达情况与甲状腺乳头状癌影响因素的单因素分析[n(%)]

表4 PD-L1及HBME-1表达情况与甲状腺乳头状癌影响因素的多因素分析

3 讨 论

甲状腺乳头状癌患者早期症状不明显，多数患者在体检时通过B超发现甲状腺结节，再通过体格检查、病理组织学检查进一步确诊。一般甲状腺乳头状癌未发生转移的患者，经手术治疗后10年生存率在80%以上。多数已出现淋巴结转移患者不具有手术适应证或通过手术无法完全切除肿瘤，在姑息治疗后预后情况较差。早期发现、确诊，并进行手术治疗是提高甲状腺乳头状癌患者预后的重要手段。甲状腺乳头状癌瘤体常为灰白色实质瘤，一般大小在1 cm以内；巨大甲状腺乳头状癌瘤体可达到6 cm，瘤体常位于甲状腺包膜周围，导致包膜受到肿瘤侵犯[11]，其中心切面似乳头状，因此称为乳头状肿瘤。但不是所有乳头状癌患者的病理标本均为典型乳头状，因此，仅依靠病理检查诊断并不适用于所有患者。随着分子生物学及免疫组化技术在医学诊断、辅助诊断中的发展，高灵敏度、高特异度的分子标志物在辅助诊断肿瘤时的应用价值逐渐升高[12]。将特异性分子标志物应用于肿瘤筛查中可提示早期肿瘤病变、是否存在淋巴结转移风险等。

HBME-1本质为一种酸性氨基酸多聚糖蛋白，常用于临床诊断或鉴别诊断间皮细胞癌、胰腺癌、肺癌及乳腺癌，免疫组化中阳性表现为细胞膜黄染[13-15]。有研究发现，在甲状腺乳头状癌中HBME-1表达量明显高于良性增生的甲状腺乳头状癌[16-17]，提示甲状腺乳头状癌的恶性病变可能与HBME-1有关。PD-L1在多种癌症中过表达，目前抗PD-L1药物已获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，临床常应用于治疗尿路转移性非小细胞肺癌[18]。

本研究通过对甲状腺乳头状癌患者的病灶组织、癌旁正常组织进行免疫组化染色，发现观察组中HBME-1及PD-L1阳性率明显升高，提示HBME-1及PD-L1确实在甲状腺乳头状癌组织中处于高表达状态，其高表达可能与甲状腺乳头状癌的发生、发展关系密切。将甲状腺乳头状癌患者临床一般特征与观察组中的HBME-1、PD-L1阳性率进行单因素分析，结果显示有淋巴结转移、侵犯包膜患者PD-L1阳性率明显升高，与曹益嘉等[19]研究结果具有一致性，提示PD-L1高表达可能与甲状腺乳头状癌发展进程有关。年龄、性别、病灶大小及肿瘤数量与PD-L1表达阳性无明显关系，但曹益嘉等[19]研究结果还表明年龄≥45岁甲状腺乳头状癌患者中的PD-L1阳性率较高，可达到79%，与本研究年龄因素研究结果不一致。分析原因可能是由于本研究纳入样本量不足，虽然≥45岁患者PD-L1阳性率可达到76.47%，但与<45岁患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。HBME-1也在有淋巴结转移、侵犯包膜的甲状腺乳头状癌患者中阳性率较高，与病灶大小、性别、肿瘤数量无明显关系。进一步多因素分析结果显示，PD-L1、HBME-1高表达是甲状腺乳头状癌患者发生淋巴结转移及侵犯包膜的危险因素，与甲状腺乳头状癌发展进程密切相关，提示PD-L1、HBME-1高表达的甲状腺乳头状癌患者具有高淋巴结转移、侵犯包膜风险。

4 结 论

PD-L1与HBME-1在甲状腺乳头状癌病灶组织中过表达，两者表达量过高与患者肿瘤发生淋巴结转移及侵犯包膜有关。PD-L1与HBME-1均可作为甲状腺乳头状癌发展过程中的敏感分子标记物，可应用于临床辅助诊断患者病情发展，指导临床选择合适的治疗方案。但由于纳入样本量有限，本研究未对PD-L1与HBME-1在甲状腺乳头状癌中的高表达机制进行深入研究，后续可对PD-L1与HBME-1在甲状腺乳头状癌中被激活的信号通路进行分析，为完善PD-L1与HBME-1在甲状腺乳头状癌中表达及其作用机制提供一定参考价值。