不同蛋白质对大黄米淀粉老化特性的影响

肖 瑜，杨新标，林 楠，郑明珠*，刘景圣

（吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林 长春 130118）

大黄米（Panicum miliaceum L.），又称软黄米，是黍子脱壳后的产物。在美国、印度、日本和非洲等多个国家，大黄米的生产和加工都较为普遍，有的国家甚至将其作为主食，而我国大黄米加工产品缺乏，对大黄米的利用率远不及国外。大黄米富含淀粉且具有丰富的蛋白、矿物质和维生素，含有较多的活性物质[1-2]。大黄米中淀粉的质量分数为70%左右[3]，而以淀粉为基础的食品大多存在易于老化、货架期短等问题，大黄米淀粉（proso millet starch，PMS）的老化严重影响其产品在贮藏过程中的品质。淀粉的老化是直链淀粉分子的缠绕、有序化和支链淀粉外侧短链重结晶所引起[4]。淀粉老化可分为短期老化和长期老化，影响淀粉老化的原因有淀粉分子结构（直链淀粉和支链淀粉的比值）、淀粉中的水分含量和外源添加物质（蛋白质、脂肪、糖、多酚和盐等）等。通常直链淀粉含量越高，老化程度越大，直链淀粉的老化可形成结晶核，且协助核结晶的增加[5]。与直链淀粉相反的是，支链淀粉含量越高，老化速度越慢，支链淀粉含量与长期老化有关[6]。由于淀粉的老化，保水能力下降，质地变硬，影响其产品的品质，造成食品浪费和经济损失[7]。

近年来，许多研究将外源添加物质如亲水胶体[8]、脂质[9]、多糖[10]和多酚[11]添加到淀粉中，从而影响淀粉的老化。蛋白质在食品行业中应用越来越广泛，在食品中添加适量的蛋白质不仅可改善食品的风味和口感，还可以提高食品的营养价值[12-14]。目前国内外研究主要集中在蛋白质的添加对淀粉理化性质及消化性影响方面。Xu Hui等[15]研究发现，用玉米醇溶蛋白（zein）微胶囊包埋淀粉颗粒，经冷冻干燥和低温喷雾干燥处理后微胶囊颗粒的慢消化淀粉、抗性淀粉含量显著增加。另外有研究表明，在35 ℃的条件下将zein与玉米淀粉混合，zein中的α-螺旋结构增加，形成黏弹性系统，从而增加了zein-淀粉面团的延展性[16]。有研究发现糯性玉米淀粉和大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）之间相互作用比普通玉米淀粉和SPI之间作用对淀粉的理化性质影响更明显[17]。并且，当蛋白质存在于食品基质中可能会影响淀粉的消化率。Yang[18]和Ma Da[19]等研究发现，凝胶化是乳清蛋白的重要功能特性，已被广泛用于改善食物的质地和味道，马铃薯和小麦淀粉可以增强乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）的凝胶化。

本实验以PMS-zein、PMS-SPI和PMS-WPI混合物为研究对象，从热特性、晶体结构、质构等方面研究添加外源蛋白质与PMS之间的相互作用对淀粉老化的影响，以期为提高糯性谷物淀粉及淀粉产品质量和附加值提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大黄米 辽宁建平县惠丰源粮食加工有限公司；zein、SPI、WPI 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FD-1A-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；高速离心机 上海安亭科学仪器厂；TA-XT Plus型物性测定仪 英国Stable Micro Systems公司；Q2000差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）仪 美国TA公司；VERTEX 70傅里叶红外光谱仪 德国Bruker公司；D/MAX2500 X-射线衍射（X-ray diffraction，XRD）仪 日本理学公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海柏欣仪器设备厂。

1.3 方法

1.3.1 PMS提取

大黄米→磨粉→过筛（100 目）→碱液浸泡（0.075 mol/L NaOH）[20]→离心→刮去上层黄褐色软层→淀粉粗浆→加水稀释成淀粉乳→调节pH 7→离心（反复洗涤沉淀3 次）→淀粉精浆→干燥（40 ℃）→PMS（100 g大黄米粉可提取60 g淀粉，其中碱液浸泡可除去谷物中的脂质，分散基质蛋白质）。

zein（150 mg/mL）先分散于60%的乙醇溶液中，再缓慢加入PMS[22]；SPI（150 mg/mL）先分散于0.067 mol/L、pH 7.8的磷酸缓冲溶液中，再缓慢加入PMS[23]；WPI（100 mg/mL）先分散于蒸馏水中，磁力搅拌30 min，置于4 ℃条件下不断搅拌过夜，调节pH 7，缓慢加入PMS[24]；将上述混合物置于90 ℃水浴搅拌30 min后，取出样品冷冻干燥，即得PMS-zein、PMS-SPI和PMS-WPI混合物，研磨过80 目筛备用。

1.3.2 PMS理化指标测定

对PMS和混合物样品进行XRD分析。采用铜靶Cu Kα，管压40 kV，管流30 mA，扫描范围2θ为5°～50°，扫描速度10°/min，步长0.02°[26]。测量结果采用MDI Jade 6.5软件进行分析。

根据直链淀粉含量，大黄米可分为2 种类型：糯性（低直链淀粉含量）和非糯性（高直链淀粉含量）[3]。本实验选用的是我国传统特色大黄米糯性品种，由表1可知，PMS中的直链淀粉质量分数较低。

嘉兴和绍兴各有1处景观得到康、乾二帝的偏爱，烟雨楼在避暑山庄中仿建，兰亭在紫禁城、清漪园、圆明园、西苑和避暑山庄等多处皇家园林中仿建。

一是金融监管法律体系的完善能创造有序整改环境，从而避免市场的顺周期性波动风险。金融监管法律法规的建立，能规范各类金融的资质，打击各种不正当经营行为，取缔非法投资商，能为市场进入和退出创新一个好的投资环境。

人类乳头状瘤病毒（HPV）感染：HPV是通过性传播感染的，有100多个亚型。对许多人来说，人乳头状瘤病毒不会对人造成伤害，多数不经治疗就可能消失。只有很小比例的HPV感染病人会患上口腔癌或口咽癌，与口腔癌和口咽癌相关的主要是16型。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是重要的豆科牧草，其环境适应能力强，粗蛋白含量丰富。紫花苜蓿内生细菌能够不同程度地拮抗多种病原真菌，抑制尖孢镰刀对紫花苜蓿造成的萎蔫作用，具有较强的生防效果[12-13]；有些内生细菌能够产嗜铁素、HCN、几丁质酶和羧甲基纤维素酶等[14]；部分紫花苜蓿内生细菌和根际细菌也因其促生能力在生产中得到广泛应用[15]。根瘤菌是有益的土壤细菌，能够在土壤中与苜蓿共生结瘤固氮，也能够在植物组织内定殖[16-18]。已有大量内生根瘤菌分离自紫花苜蓿的种子[19-20]、花、叶、茎和根[21-22]。

1.3.4 样品凝胶质构特性的测定

1.3.5 傅里叶红外光谱扫描

样品（高为2 cm的圆柱体）的凝胶质构性质通过TA-XT物性检测仪测定。参考物性仪质构分析（texture profile analysis，TPA）测定模式，采用圆柱形金属探头（P/0.5R，平底）。测试条件：测前速率1.0 mm/s；测试速率2.0 mm/s；测后速率2.0 mm/s；压缩程度40%；2 次压缩间隔为2 s，每个样品做3 组平行实验，得到质构参数曲线。通过Texture Expert Excede Version 1.0（Stable Micro Systems Software）软件分析处理数据，得到硬度、黏附性、胶黏性和咀嚼性。

相较于其他教学模式,案例教学着重强调培养学生解决问题能力及创新能力,不再停留于获取固定化原理知识或规律知识的阶段,激发学生求知欲及学习热情。除获取课程知识外,案例教学能大大提高学生表达能力,树立学生面临困难解决困难的信心及决心,一定程度上缩小实践与教学间差距,增强学生决策能力,真实反映学生职业行为能力的高低。同时,案例教学模式能充分激发学生学习主动性及积极性,给予更多学生对外展示自身能力的机会及平台,有利于提高教师自身业务水平锻炼其业务能力,实现教学双方良好互动[4]。此外,由于案例教学仿真性、创造性及能动性较强,是强化学生理论联系实际能力的有力手段。

参考Cai Jinwen等[25]方法并稍作修改。称取1 mg样品与100 mg溴化钾充分混合研磨，在15 MPa下抽真空压片1 min。扣除溴化钾薄片的背景，于4 000～400 cm－1下扫描64 次，分辨率为4 cm－1，使用Origin 8.5进行数据处理，得到红外光谱图。

1.3.6 XRD分析

近日，据媒体报道，华润置地首席执行官吴向东确认加入华夏幸福。12月4日下午6点，华夏幸福发布公告称，决定聘任俞建为公司联席总裁，分管财务及融资等业务。吴向东曾经的搭档——华润置地前CFO俞建已先吴向东一步就任。

准确称取PMS及其混合物各20 g，加入80 mL蒸馏水搅拌混合后置于蒸锅中加热20 min，将糊化后的样品置于4 ℃条件下贮存1、7、15 d。一部分用于质构特性的测定，另一部分冻干粉碎过100 目筛备用。

蛋白质含量测定参考GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》；水分含量测定参考GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》；脂肪含量测定参考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》；采用总淀粉试剂盒和直链淀粉/支链淀粉试剂盒（伴刀豆球蛋白A方法）[21]测定淀粉含量；灰分测定参考GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》。

1.3.7 热特性分析

参考Wang Lili等[27]方法，稍作改动。准确称取3 mg样品置于DSC坩埚中，并加入10 μL去离子水，混合均匀后密封。将密封后的坩埚于室温条件下平衡24 h，用空坩埚作参比。通入氮气（氮气流速50 mL/min），升温速度10 ℃/min，由30 ℃升至130 ℃，得到起始温度（To）、峰值温度（Tp）、最终温度（Tc）和老化焓值（ΔH）。每个样品测定3 次平行。

Avrami方程被广泛用于研究淀粉老化动力学[28-29]，方程表示如下：

公平公正的判卷是保证考核评价改革效果的重要环节。改革前，期末考试往往由任课教师一人进行判卷，系主任进行审核但并未深究评分的“宽严”程度。改革后，期末试卷实行系主任负责的教师集体阅卷模式，开展评卷质量的自评和互评，尽量减少评卷的随意性，保证评分尽可能科学合理。

式中：R为样品结晶率；Ht、H0和H∞分别为t、0、∞时间的焓变/（J/g）；k为结晶速率常数；n为Avrami参数。

1.4 数据处理

采用SPSS 24.0对数据进行统计分析和处理，采用Duncan法进行差异显著性分析，P＜0.05，差异显著，数据以表示。

2 结果与分析

2.1 PMS的成分分析

表1 PMS成分分析结果Table 1 Composition of proso millet starch%

1.3.3 样品的制备与处理

2.2 质构特性分析

表2 PMS-蛋白质混合物老化1、7、15 d的质构特性Table 2 Texture pro files of proso millet starch-protein mixtures stored for 1, 7 and 15 d

采用TPA测定不同蛋白对PMS的凝胶质构特性的影响，结果如表2所示。在4 ℃条件下贮存15 d，添加zein的PMS凝胶硬度从727.50 g降至688.67 g，SPI和WPI的添加显著降低了PMS的硬度（P＜0.05），其硬度分别降至630.93 g和397.52 g。样品凝胶的硬度随着贮存时间的延长而增加，这与Singh等[30]研究结果一致。而随着贮存时间的延长，样品凝胶硬度逐渐增大，这主要是由于淀粉长期老化引起的，老化初期，直链淀粉在氢键的作用下，可形成具有一定韧性的淀粉凝胶网络结构[31]，分子间的缠绕程度越强，其形成的网络结构强度则越高，而支链淀粉的重结晶则进一步增强网络结构的刚性。PMS含有较高的支链淀粉，支链淀粉外链长的淀粉容易老化。添加蛋白后，淀粉-蛋白体系的硬度降低表明在凝胶贮存的过程中蛋白质可降低淀粉的硬度，这可能是因为蛋白质会导致淀粉微相区浓度下降，抑制淀粉分子进行重排，从而延缓淀粉老化[32]。黏附性指淀粉凝胶黏附在其他物体上的能力，反映探头测试样品的黏着作用所消耗的功。添加蛋白质的PMS形成的凝胶比不添加蛋白质所形成的凝胶具有更高的黏附性，并且黏附性和贮存时间呈反比。样品的胶着性和咀嚼性也随着贮存时间的延长而增加，而添加不同蛋白质导致了不同的结果，这可能是由于3 种蛋白质之间的结构组成不一致，并且淀粉凝胶的机械性质亦取决于淀粉分子的结构。淀粉凝胶的质构特性是决定食品体系中淀粉性能的重要标准。综上可知，添加WPI，随着贮存时间的延长，体系的硬度增加最为缓慢，延缓PMS老化的效果最好。

2.3 傅里叶红外光谱分析

淀粉在其分子内和分子间存在大量维系体系三维结构的氢键[33]。采用傅里叶红外光谱对老化不同时间的样品进行检测，结果如图1所示。

图1 PMS-蛋白质混合体系的红外光谱图Fig. 1 FTIR spectra of proso millet starch-protein mixed systems stored for different periods

从图1可以看出，样品在3 500～3 200 cm－1处呈现的一个宽而强的吸收峰，这是多聚体分子间典型的缔合羟基特征峰，说明淀粉分子间的晶体是通过氢键紧密相连的。PMS-zein体系是N—H键的收缩振动，PMS-SPI和PMS-WPI则是O—H键的收缩振动。添加不同蛋白质后，吸收峰往低波长方向移动，说明体系之间的氢键作用力在增强。在2 930 cm－1左右处的吸收峰为C—H键的振动吸收峰，这与淀粉中蛋白和脂肪含量相关[34]，由图1可看出，淀粉-蛋白体系在2 930 cm－1处的吸收峰强于淀粉。PMS和淀粉-蛋白体系在1 650 cm－1处呈现强的特征吸收峰，是因为C＝O的弯曲振动，而不同于PMS，淀粉-蛋白体系在1 525 cm－1附近为蛋白特征吸收峰（酰胺II）[35]。本实验研究发现，添加3 种蛋白质后未出现新的特征吸收峰，说明蛋白质的加入并未和淀粉形成新的基团，主要还是通过氢键作用力构成一个紧密缠绕的三维凝胶网络结构。

临上车之前，老婆接到了一个电话。电话依旧是姚琳琳打来的，是再次来电话劝老婆退票的。老婆说：雨辰病了这么久，都没查出到底得的是啥病，不能再耽搁了，能早到哈尔滨一天是一天。你就放心吧，火车的安全系数高，应该不会有事儿的。姚琳琳说：你说的也是。那我就不劝你了，你自己路上多加小心吧。到了那边儿，别心痛钱，有什么困难别忘了给我打电话。需要人手的话就让我家裘子去，他干别的不行，跑个道儿，学个舌的还行。老婆就有点儿感动，感动得眼圈儿都红了，说：琳琳，谢谢你了，真的谢谢你了。

由表2可以看出，在单门槛效应检验中，F统计量为20.792 8，Bootstrap计算得到的P值为0.000 0，表明在1%的显著性水平下可以拒绝不存在门槛值的原假设，即存在一个门槛值。在双门槛效应检验中，F统计量为13.361 4，P值为0.000 7，表明在1%的显著性水平下拒绝存在1个门槛值的原假设，即存在两个门槛值。在三门槛效应检验中，F统计量为3.368 6，P值为0.113 7，表明即使在10%的显著性水平下也无法拒绝存在2个门槛值的原假设，因此，我们接受存在两个门槛值的检验结果，到此结束对门槛效应的检验。

2.4 结晶结构分析

在4 ℃下贮存1、7、15 d后，对老化的样品进行XRD分析，从而评价样品的老化特性。淀粉因品种来源和结晶结果的差异而形成不同类型的XRD图谱[36-37]。淀粉主要分为结晶型和非结晶型，而淀粉的结晶结构主要有A、B、C、V 4 种类型，A型主要存在谷物中，一般在15°、23°处有较强的单衍射峰，17°和18°处有较强的双衍射峰。如图2所示，老化1 d的样品在17°左右出现较强衍射峰，这是典型的B型结晶结构。老化样品呈现B型结晶结构可能是由于在加热过程中部分颗粒结晶度消失，同时伴随着聚合物和溶剂（脱水收缩）之间的刚性和相分离逐渐增加。老化样品的峰接近17°，峰的形成是淀粉无定性区的熔融结晶的结果，主要可能是因为支链淀粉部分的重结晶，这也表明淀粉A型结晶结构15°的特征峰经过糊化后被破坏[27]。加入不同蛋白质后XRD的峰强度减弱，一般的，XRD的峰强度表明了糊化后淀粉的老化程度[38]，衍射峰越高越窄，老化程度越强。本研究表明，加入蛋白后可抑制PMS的老化，这与TPA和DSC结果一致。

2.5 热特性分析

表3 PMS-蛋白质混合物老化7 d和15 d的热特性Table 3 Thermal properties of proso millet starch-protein mixtures stored for 7 and 15 d

如表3所示，贮存期间老化样品的To、Tp和Tc变化不大，这与之前的研究一致[17,39]。Tp基本在50 ℃左右，属于支链淀粉老化的解离峰[40]。如图3所示，样品老化1 d在30～130 ℃的升温过程中并未从老化曲线观察到老化焓，而样品在贮存7 d和15 d再加热的过程产生热转变，表明样品在贮存的过程中发生老化。随着贮存时间的延长，样品的焓值逐渐增大，这表明在贮存期间支链淀粉结晶融化需要更多的能量[41]。贮存15 d之后PMS焓值变化从第7天的2.48 J/g升至3.51 J/g，含有蛋白质的PMS老化焓比PMS低，这可能是因为蛋白质的存在减少了淀粉的含量，因此蛋白质可以降低淀粉的老化。另一方面，PMS中的支链淀粉含量较大，而支链淀粉比直链淀粉更易重结晶，会呈现更高的老化焓。DSC结果显示，WPI比zein和SPI对PMS老化的影响更大。结果表明在PMS中添加蛋白质可以抑制淀粉的老化，尤其是可以抑制支链淀粉的重结晶。

图3 PMS-蛋白质混合体系的DSC图谱Fig. 3 DSC of proso millet starch-protein mixed systems

2.6 结晶动力学分析

通过老化过程的模型化研究，可以掌握由老化引起的淀粉食品品质的变化规律，对食品品质的预测和控制有较大意义。淀粉回生焓值反映晶体的熔化，且其晶体熔化形成的吸热峰是支链淀粉长期回生后再熔化引起的，而非直链淀粉[8]。淀粉在结晶过程中生成的结晶属于天然高分子，Avrami方程描述了贮存期间焓的变化，因此采用Avrami模型描述淀粉回生过程，该模型可表达晶核成核方式和生长速率。

图4 DSC检测PMS-蛋白质混合体系老化Fig. 4 Retrogradation of proos millet starch-protein mixtures monitored by DSC

建立老化动力学模型研究3 种蛋白对PMS老化性质的影响，利用DSC测定4 ℃下保存不同时间样品的老化焓，结果如图4所示。随着贮存时间的延长，所有样品的老化焓增大，表明形成的结晶更多，需要更多的能量融化。将老化不同时间的老化焓代入式（1）中，得到样品动力学方程及参数（表5）。

表5 PMS-蛋白质混合体系老化动力学模型（44 ℃）Table 5 Avrami models for retrogradation kinetics of proso millet starch-protein mixtures (4 ℃)

由表5可知，老化动力学数据符合Avrami方程（R2=0.985 7～0.997 4）。Avrami指数（n）反映了成核过程的晶体形态，n值越小，成核越快。由表5可知，PMS-蛋白质混合体系主要是以自发成核为主（1＜n≤2），其成核类型为接近于散发性核的棒状生长方式[27,42]，这和XRD结果一致。加入蛋白质的PMS的n值均高于不含蛋白质的PMS，表明晶核在结晶开始形成时成核速度变慢。淀粉结晶速率常数（k）代表重结晶的速度，其可能受到支链淀粉的比值、温度、pH值、淀粉颗粒大小分布和非淀粉组分的影响[43]。k值越大，结晶速率越快，加入蛋白质的样品的k值比PMS的更低，表明加入蛋白后体系的重结晶增长速率降低，因此，蛋白质的存在影响了支链淀粉回生。3 种蛋白对PMS成核及结晶速率的影响程度不同，这可能是因为3 种蛋白的结构和分子质量不同，WPI对PMS的影响最大，其成核较慢，这是由于成核方式偏向于棒状生长方式。不同分子质量的蛋白可能有助于淀粉和蛋白混合体系k值的差异。

3 结 论

研究了3 种不同蛋白质和PMS混合体系的质构特性、热力学性质、结晶结构等，通过这些指标表征蛋白质对PMS老化的影响。研究结果发现zein、SPI和WPI以不同程度延缓PMS的老化。与PMS相比，PMS-蛋白质混合体系的硬度下降，质地变得较为柔软，贮存期的稳定性提高，表明改善了PMS的品质。红外图谱表明3 种蛋白质和PMS之间没有形成新的特征峰，主要是通过氢键形成一个紧密缠绕的三维凝胶网络结构。由于支链淀粉的重结晶或是因加热而使部分结晶消失，老化后的样品呈现典型的B型结构，XRD峰强度随着贮存时间的延长而增加，而含有蛋白质的PMS峰强度弱于PMS，说明蛋白质可以延缓PMS的老化，这与TPA和DSC的结果一致。热焓值随着贮存时间的延长而增大，热焓值的增加与支链淀粉的重结晶有关，同时，添加蛋白质后混合体系的热焓值减小，说明蛋白质的加入可以抑制PMS的长期老化，其动力学模型（Avrami方程）表示蛋白质可以延缓支链淀粉重结晶的速率，并且体系的成核方式均偏向于散发性的棒状生长（1＜n≤2），符合XRD的结果。3 种蛋白质对PMS的老化性质影响程度不一致，可能是因为3 种蛋白质的结构和分子质量不同，这表明蛋白质可以抑制PMS的老化，其中WPI对PMS的影响最为明显。