基于网络药理学和分子对接方法的肺维康颗粒治疗COVID-19相关肺纤维化的机制分析

杨帆，李宛洋，曹仁爽，毕张扬，张伟

1山东中医药大学中医学院，济南250014；2中南大学湘雅公共卫生学院；3山东中医药大学附属医院

自2019年底至2020年3月下旬，新型冠状病毒(2019-nCoV)已在我国肆虐3个月之久，全国超8万人感染。世界卫生组织将2019-nCoV引起的肺炎命名为COVID-19，目前国内已有大批患者治愈出院进入恢复期。但影像学研究显示，COVID-19患者在初诊时即有纤维索条灶形成，部分患者治疗后复查CT显示伴有纤维索条灶[1]，而重症COVID-19死亡患者也存在肺间质纤维化的病理特点[2]。2020年3月，山东中医药学会肺系病专业委员会、山东省医师协会中医肺系病医师分会制订《中医药调治新冠肺炎恢复期专家共识》，该共识建议应用肺维康颗粒治疗COVID-19相关肺纤维化(COVID-19-PF)。网络药理学一种是建立在网络数据库检索及高通量组学数据分析基础上的生物信息网络构建及网络拓扑结构分析策略[3～5]，分子对接是通过分析受体与分子之间的相互作用等方式来预测其结合模式和亲合力的一种模拟方法[6]。2020年3月，本研究应用网络药理学和分子对接方法，对肺维康颗粒治疗COVID-19-PF的潜在成分、靶点及作用机制进行系统性探索，以期为COVID-19-PF的基础研究及相关药物研发提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 肺维康颗粒活性化合物与防治COVID-19-PF的靶点获取 通过中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，检索肺维康颗粒中十味中药(黄芪、白术、防风、丹参、地黄、山药、山萸肉、茯苓、淫羊藿、麦冬)的有效成分。本研究以数据库所建议的口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18建立阈值筛选候选化合物。活性化合物作用靶点通过检索TCMSP数据库逐一配对整理获取，同时检索GeneCard、OMIM数据库，以novel coronavirus、pulmonary fibrosis为关键词，得到COVID-19-PF相关基因。利用Uniprot(http：//www.uniprot.org/)数据库查询靶点蛋白对应的基因名称，对靶点蛋白标准化，建立数据集。应用R软件包，对肺维康颗粒活性成分作用的靶点及疾病靶点取交集，并绘制韦恩图，获得共同靶点基因。

1.2 药物-化合物-靶点-疾病网络构建 将候选化合物与二者的共同靶点基因上传至Cytoscape3.7.1软件，生成体现药物-化合物-靶点-疾病相互作用的四元综合网络图。

1.3 药物-疾病靶点蛋白相互作用网络构建 将筛选出的共同靶点基因导入STRING(https://string-db.org/)与Metascape(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)平台，将蛋白种类定义为Homo sapiens并进行筛选，获得蛋白互作网络图(PPI网络图)，并进行MCODE模块分析。应用R软件包，绘制条形图展示关键靶点在网络中相互作用的频次(Degree)。

1.4 GO功能与KEGG富集分析 应用R语言软件包和Metascape平台，对共同靶点基因进行GO功能和KEGG通路富集分析，根据筛选出的信号通路绘制条形图、气泡图。对GO功能分析功能相似的条目进行聚类分析，并构建相互作用网络，对KEGG富集分析的通路结果绘制靶点-通路网络。

1.5 分子对接 在PDB(https://www.rcsb.org/)数据库，以人(Human)来源检索相关化合物与关键靶点的晶体结构；采用AutoDockTool软件进行去水、加氢等预处理，采用Discovery studio软件进行分子对接；分析结合能值，该数值为负则提示能自由结合[9]。本研究设定结合能<-5 kcal/mol(20.9 kJ/mol)为结合具有显著性，以此佐证肺维康颗粒在COVID-19-PF中应用的合理性。

2 结果

2.1 肺维康颗粒-化合物-靶点-COVID-19-PF网络的构建结果 以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，结合文献手动筛选结果，共得到肺维康颗粒候选化合物186个，其中淫羊藿23个、地黄2个、山茱萸20个、山药16个、黄芪20个、茯苓15个、防风18个、丹参65个、白术7个。靶点数较多的化合物包括槲皮素、5-O甲基维斯阿米醇、山奈酚、薯蓣皂苷元、芒柄花黄素、异鼠李亭等，基本覆盖了肺维康颗粒中已知的关键活性成分。在TCMSP数据库中逐一对应靶点，重复靶点仅保留1个，共得到2 558个化合物靶点。基于uniprot数据库进行靶点信息基因名标准化，得到1 911个靶点。

2.2 PPI网络图的构建结果 韦恩图结果显示，肺维康颗粒化合物与COVID-19-PF有190个共同靶点基因。PPI网络包含190个蛋白质节点、3 474条相互作用关系(连线)。根据节点的Degree绘制前30个关键蛋白质节点的条形图，见图1。Degree≥100的节点包括蛋白激酶(AKT1)、白细胞介素6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、Caspase-3、表皮生长因子受体(EGFR)，其中Degree最高的3个蛋白质节点分别为AKT1、IL-6、VEGFA(Degree分别为127、115、109)。MCODE模块分析显示，log10<-6的模块一共有7个，同一模块内的蛋白有着更为紧密的联系；排名前三的模块具有较显著的生物学意义，其中模块1与血管生成和重塑有关，模块2与炎症反应和细胞周期调控相关，模块3与胶原重塑、氧化应激、纤维化有关。

图1 PPI网络中的关键节点

2.3 GO基因功能与KEGG信号通路富集分析结果 对190个共同靶点进行GO基因功能分析，共得到生物过程180条，通路富集分析共得到KEGG信号通路165条，见图2。GO功能相似条目聚类分析与相互作用结果显示，核受体活性、转录因子活性(TFA)、类固醇激素受体、肾上腺素能受体活性、G蛋白偶联胺受体活性等因子富集较多。KEGG通路富集筛选结果显示，与COVID-19-PF相关的通路主要为PI3K/AKT、AGE/RAGE、IL-17、Influenza A、TNF信号通路等。

2.4 分子对接结果 肺维康颗粒特征性成分薯蓣皂苷元、二氢丹参酮Ⅰ、木犀草素及常用于治疗肺纤维化的药物吡非尼酮与血管紧张素转化酶2(ACE2)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、AKT1的分子对接结合能均<-5 kcal/mol，其分子对接模式见图3。

3 讨论

截至2020年3月22日24时，国内现有COVID-19确诊病例5 120例，累计治愈出院病例72 703例[7～10]，表明目前疫情已转入恢复期治疗阶段。针对患者恢复期的调养，国家中医药管理局印发了新型冠状病毒肺炎恢复期中医康复指导建议[11]，但该建议未有针对COVID-19-PF的相关治疗措施。COVID-19重症患者2019-nCoV在肺组织内诱发细胞因子风暴，与其他病毒诱发肺纤维化的病理机制类似[12]。临床上用于治疗肺纤维化的药物如糖皮质激素、吡非尼酮、尼达尼布等往往不能阻断病程，但中西医结合治疗该病取得了一定的效果，如临床观察发现玉屏风散联合糖皮质激素对放射性肺炎、肺纤维化具有良好的疗效，疗效评分显著高于单用糖皮质激素[13]。考虑到COVID-19患者恢复期存在“复阳”情况、排毒时相较长，且长时间病毒感染更容易引起肺纤维化，共识将肺维康颗粒的应用时机界定至自恢复期始，经山东省药品监督管理局快速备案[鲁药制备(应急)字Z2020002]后开始使用。本次专家共识推荐应用肺维康颗粒治疗COVID-19-PF的机制尚不完全清楚，有待对其药理机制进行探索。

注：A为GO功能分析气泡图；B为KEGG通路富集分析气泡图。

注：A为二氢丹参酮Ⅰ与ACE2的分子对接模式，结合能为-26.39 kcal/mol；B为二氢丹参酮Ⅰ与VEGFR的分子对接模式，结合能为-23.18 kcal/mol；C为薯蓣皂苷元与ACE2的分子对接模式，结合能为-33.17 kcal/mol；D为薯蓣皂苷元与AKT1的分子对接模式，结合能为-47.50 kcal/mol；E为木犀草素与AKT1的分子对接模式，结合能为-38.47 kcal/mol；F为木犀草素与VEGFR的分子对接模式，结合能为-35.10 kcal/mol；G为吡非尼酮与AKT1的分子对接模式，结合能为-22.72 kcal/mol；H为吡非尼酮与VEGFR的分子对接模式，结合能为-29.60 kcal/mol。

本研究网络药理学分析结果显示，槲皮素、山奈酚、木犀草素、汉黄芩素、β-谷甾醇、薯蓣皂苷元、二氢丹参酮Ⅰ、淫羊藿C是肺维康颗粒发挥疗效的重要活性成分。研究证实，槲皮素通过降低TGF-β1、TNF-α表达和干预TGF-β1/Smad信号通路而减轻大鼠肺组织炎症反应和纤维化[14]；汉黄芩素能够抑制TNF-α和IL-1β表达，降低肺组织炎症反应程度[15]。廖源等[16]以网络药理学方法分析了国家《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》中期诊疗方，发现中期诊疗方可通过调控AKT1、IL-6、VEGFR等肺炎相关靶点发挥治疗COVID-19的作用，与肺维康颗粒治疗COVID-19-PF的核心作用靶点相似；提示肺维康颗粒不仅可以兼顾到早期COVID-19-PF患者仍可能存在2019-nCoV感染的特点，还能有效发挥对COVID-19的治疗作用。本研究分子对接结果显示，肺维康颗粒中的多种成分如木犀草素、薯蓣皂苷元，与AKT1、VEGFR的结合能均低于肺纤维化常用药物吡非尼酮与上述靶点的结合能，表明肺维康颗粒在COVID-19-PF治疗中有较高的应用价值。

本研究对药物-疾病靶点蛋白相互作用网络分析结果显示，靶点AKT1、VEGFR、IL-6、JUN、MAPK1、MAPK8在网络中占据核心地位。其中AKT1是mTORC2信号通路重要的下游靶蛋白，后者属于磷脂酰肌醇3-激酶蛋白家族，被认为是调节细胞增殖、代谢及自噬的中心枢纽。AKT1可通过mTOR蛋白磷酸化而激活，并促进相关蛋白表达，进一步促进基因转录和蛋白质合成，在纤维化过程中具有重要作用[17]。因此,AKT1激活后可参与细胞凋亡、葡萄糖代谢和蛋白质合成过程，从而调节细胞存活和增殖，在肺纤维化过程中占据重要地位。VEGFR是VEGF的功能受体，是介导血管生成的重要靶点[18]，由此产生的异常损伤修复刺激成纤维细胞增殖、聚集，并促进上皮间质转化、激活多条异常信号通路，进一步诱导成纤维细胞灶形成，并导致MMPs家族激活破坏肺泡结构、促进基质沉积和瘢痕形成。该机制也得到了后续GO功能和KEGG通路富集分析的验证，推测肺维康颗粒可能通过调控PI3K/AKT等炎症和纤维化相关通路、抑制细胞因子活化和血管生成、减轻胶原沉积和肺组织结构重塑，而发挥对COVID-19-PF的治疗作用。

综上所述，肺维康颗粒可能通过调控PI3K/AKT等炎症和纤维化相关通路、抑制细胞因子活化和血管生成、减轻胶原沉积和肺组织结构重塑等发挥对COVID-19-PF的治疗作用。本研究为基础实验研究和临床应用提供了较全面的理论基础，限于现有COVID-19相关数据的片面性，加之本方法不能预测活性成分剂量效应与药物的相互作用，故研究结论具有一定局限，有待于后续采用动物体内外实验进一步探讨完善。