瓜氨酸对溃疡性结肠炎大鼠肠道炎症损伤及外周血单核细胞的影响

蔡 彬，李春伟，周敏红，周阿成，储正达，黄华丽，黄晓东

无锡市中医医院 1.肛肠科；2.消化科，江苏 无锡 214000

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种病因尚未明确的肠道黏膜慢性非特异性炎症性疾病，病变部位主要累及直肠和乙状结肠，也可逆行向结肠近端扩展，甚至累及全结肠和末端回肠，其主要临床症状为持续或反复发作的黏液脓血便、腹痛、腹泻伴里急后重，以及不同程度的全身症状。近期研究发现，UC疾病过程中存在精氨酸(arginine, Arg)的利用与代谢异常，活动期UC患者的肠道组织中Arg水平显著降低[1]。动物实验则发现对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt, DSS)诱导的小鼠结肠炎模型补充外源性Arg可以改善结肠炎小鼠体质量降低及结肠重量减轻的情况，同时提高生存率及减轻肠道炎症反应[2]。Arg是一种非必需氨基酸，机体Arg主要来源于三个方面：经日常饮食摄入于小肠吸收，通过其他氨基酸内源性合成，以及通过体内蛋白质分解生成。小肠自身会直接消化分解掉部分Arg，吸收的Arg还会发生首过效应被肝脏分解，同时UC肠道炎症状态也会影响Arg的吸收，因此UC患者直接补充Arg的生物利用率和转化效率相对较低。

瓜氨酸(citrulline, Cit)是一种非蛋白质α-氨基酸，作为Arg的前体氨基酸，在体内由精氨酸琥珀酸合成酶(arginosuccinate synthetase, ASS)以及精氨酸琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase, ASL)的共同作用下生成Arg。Cit的优点在于不会被肝脏分解，因此其生物利用率更高，并且转化生成Arg是体内Cit唯一的代谢途径。研究报道补充Cit比直接补充Arg可以更有效地提高体内Arg的含量[3]。因此，本课题拟探讨直接补充Cit对UC是否具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物清洁级Wistar雄性大鼠15只，体质量(220±20)g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号: SCXK(苏)2011-0003。分笼饲养于无锡市转化医学研究所实验动物中心，饲养温度为24～26 ℃，湿度为50%～70%。

1.2 药物与试剂L-瓜氨酸：北京索莱宝科技有限公司，批号：1019B021；4% 多聚甲醛：上海源叶生物科技有限公司，批号：L21J9G64082；2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)：美国 Sigma公司，批号：2508-19-2；无水乙醇：无锡市展望化工试剂有限公司，批号：180525；水合氯醛(10% w/v)：上海源叶生物科技有限公司，批号：L21J9G64081。

1.3 主要仪器高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，超低温冰箱(中国青岛海尔公司)，光学显微镜(日本Olympus公司)，凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)，电泳槽，电泳仪等。

1.4 动物模型制备大鼠适应性喂养7 d后，按照文献[4]的方法制备2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇诱导大鼠UC模型，具体方法：将5% TNBS与50%乙醇等体积混合作为造模剂，用头皮针制成8 cm长橡胶软管，大鼠麻醉后, 将橡胶软管从大鼠肛门插至距肛门8 cm处，按4 ml/kg剂量TNBS/乙醇造模液缓慢灌入大鼠肠腔, 灌注完成后提起大鼠尾部倒置30 s，待大鼠苏醒后放回笼中，自由饮食，及时观察大鼠情况。

1.5 动物分组将15只Wistar雄性大鼠按照随机数字表法分为3组，即正常组、UC模型组(UC 组)和Cit给药组(UC+Cit 组)，每组5只。正常组大鼠给予0.8 ml生理盐水灌肠，UC组 和UC+Cit组行TNBS/乙醇法造模，术后第二天起正常组和UC组大鼠给予4.0 ml/d生理盐水灌胃，UC+Cit组大鼠给予Cit(900 mg·kg-1·d-1)灌胃给药，每次灌胃容积为4 ml。

1.6 标本采集及处理连续灌胃给药7 d后，禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，腹主动脉取血，部分血置于EDTA抗凝管内送检进行单核细胞计数及比例检测，部分血高速低温离心机 4 ℃ 3 000 r/min，离心 15 min，分离血清置于EP管中，-80 ℃冻存备用。大鼠采血完毕后切开腹腔，从肛门以上2 cm 处，向上截取结肠8 cm，4 ℃生理盐水灌注清洗干净，滤纸吸干。肉眼观察结肠病变情况，并记录结果。将结肠分成两段，一段置于-80 ℃冰箱冷冻保存；另一段用4%多聚甲醛液固定，48 h后常规方法制备石蜡切片，行苏木精-伊红(HE)染色后在倒置显微镜下观察结肠病理变化。

1.7 主要观测指标

1.7.1 一般状况及疾病活动指数(DAI)评分：每天观察大鼠一般状况，包括：精神状态、活动情况、进食饮水、毛色变化、大便性状、颜色及有无出血等情况，每日定时对大鼠称重，参照文献[5]进行DAI评分。UC大鼠DAI评分=(体质量下降率得分+大便性状得分+血便得分)/3(见表1)。

表1 UC大鼠DAI评分

1.7.2 结肠组织病理学观察：剪取病变严重的结肠组织，用4%多聚甲醛液固定48 h后，石蜡包埋连续切片，厚度为4 μm，HE染色后在倒置显微镜下观察结肠病理变化。UC肠道组织病理学表现主要为正常上皮细胞缺失，隐窝结构改变，杯状细胞减少，以及大量炎症细胞浸润。

1.7.3 外周血单核细胞检测：取置于EDTA抗凝管内的大鼠血液，用全自动血液分析仪进行外周血单核细胞计数及单核细胞比例检测。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化的比较连续灌胃给药7 d后，正常组存活5只，UC 组存活3只，UC+Cit 组存活4只。各组大鼠体质量变化情况如图1所示：正常组大鼠7 d后体质量升高，UC组和UC+Cit组大鼠体质量下降。UC组大鼠造模后7 d体质量相比0 d时的初始体质量显著减轻(P<0.05)，而UC+Cit 组大鼠7 d和0 d时的体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示补充Cit可以减轻UC大鼠体质量降低的程度。

图1 各组大鼠造模7 d后体质量变化的情况

2.2 各组大鼠DAI评分的比较各组大鼠DAI评分的比较见表2，结果显示：与正常组比较，UC组和UC+Cit 组大鼠DAI评分升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与UC组比较，UC+Cit组大鼠DAI 评分降低，两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠DAI评分的比较

2.3 各组大鼠结肠组织病理形态学的比较正常组大鼠结肠黏膜上皮平整，杯状细胞丰富，腺体结构清晰，排列整齐，黏膜固有层内毛细血管和淋巴细胞少见(见图2A)；UC组大鼠黏膜上皮出现溃疡缺损，可见黏膜充血，腺体结构破坏明显，杯状细胞大量减少，大量炎症细胞浸润(见图2B)；UC+Cit组大鼠黏膜上皮尚完整，内见轻度充血，腺体结构尚清晰，杯状细胞减少不明显，周围分布少量炎症细胞(见图2C)。

图2 各组大鼠结肠组织病理学变化情况(放大100倍) A:正常组；B:UC组;C:UC+Cit组

2.4 各组大鼠外周血单核细胞的比较与正常组比较，UC组大鼠外周血单核细胞计数和单核细胞比例显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与UC组比较，UC+Cit 组大鼠外周血单核细胞计数和单核细胞比例显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

表3 各组大鼠外周血单核细胞的比较

3 讨论

UC治愈难度大，复发率高，且与结肠癌的发生有关，已被世界卫生组织列为现代难治病之一，受到医学界的广泛重视。《Lancet》杂志最新一份关于全球范围内UC发病率及流行程度的报道显示，作为一直以来的高发地区，北美和欧洲UC发病率分别高达每年23.14/10万和57.9/10万，其患病率在欧洲(挪威)最高可达505/10万，北美(加拿大)则为319/10万[6]。过去，中国作为欠发达国家被认为是UC发病率较低的地区，但最新流行病学数据显示，中国大陆UC的患病率和发病率呈急剧上升趋势，有统计数据显示目前我国UC发病率为1.33/10万[7]。UC发病机制尚不明确，一般认为与遗传、免疫、感染、环境等因素相关。临床上对UC的治疗以氨基水杨酸类药物、肾上腺糖皮质激素类药物及免疫抑制剂为主，但这些药物都存在一定的不良反应[8]。

于是，有研究者将目光投向日常膳食营养中氨基酸类营养素上。Shiomi等[9]报道DSS诱导的急性结肠炎模型小鼠血清和结肠组织中谷氨酰胺(Gln)含量显著降低，对模型小鼠补充Gln可以明显减轻肠道的炎症反应，包括减少小鼠体质量的丢失，减轻上皮细胞的损伤，缓解肠道的水肿，以及改善肠道黏膜结构的完整等。Coburn等[2]通过对UC小鼠补充Arg，发现小鼠体质量下降以及结肠重量减轻的症状得到改善，促炎细胞因子和趋化因子的表达显著降低。同时，Arg还能增加UC小鼠结肠上皮细胞的迁移能力，提高肠道黏膜的修复能力。此外，色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、蛋氨酸(Met)、苏氨酸(Thr)等同样被报道具有保护肠道、抵抗肠道炎症反应的作用[10]。

Cit是一种最初被发现于西瓜汁，且不存在于蛋白质中的L-α-氨基酸，正常机体中的Cit主要在小肠上皮细胞内合成，上皮细胞将Gln及谷氨酸转变为Cit，然后在肾脏中经肾小管上皮细胞转化为Arg[11]。本研究结果显示，UC模型组大鼠造模7 d后体质量相比初始体质量显著下降，说明造模效果满意。连续7 d给予补充Cit的UC大鼠的体质量较初始体质量并未出现显著降低，说明补充外源性Cit可以改善UC导致的大鼠体质量减轻的症状。此外，在对结肠组织HE染色病理观察中，同样证实补充Cit可以减轻UC大鼠结肠黏膜炎症损伤程度。镜下发现补充Cit的UC大鼠结肠组织其黏膜上皮和腺体结构的完整性、杯状细胞的数量及炎症细胞的浸润程度均优于UC组。

单核细胞是外周血白细胞的一个亚型，在组织中可分化为巨噬细胞和树突状细胞，并在先天性免疫中发挥重要作用。在炎症性疾病中，单核细胞自骨髓中生成，并通过释放促炎细胞因子、趋化因子或其他病原相关因子参与炎症反应[12]。Cherfane等[13]研究报道，UC患者外周血单核细胞的数量与UC疾病活动度密切相关，并提出单核细胞计数可以作为潜在的UC疾病生物标志物。严伟等[14]通过研究306例不同病情严重程度的UC患者外周血单核细胞计数，结果同样提示单核细胞计数与UC疾病严重程度具有重要关系。而本研究发现补充Cit的UC大鼠血液中单核细胞计数、单核细胞比例明显低于UC模型组，这一结果进一步证实补充外源性Cit对UC炎症反应具有保护作用。

综上所述，本研究证实补充外源性Cit对UC肠道的炎症损伤具有保护作用，并且发现补充Cit可以降低UC大鼠外周血单核细胞的数量及比例。单核细胞在特异性免疫与非特异性免疫中均发挥重要作用，单核细胞受炎症介质刺激可以分泌细胞因子，分泌的细胞因子可以进一步激活多种信号途径促进大量细胞因子及炎症介质释放。因此，课题组下一步的课题研究就集中在Cit对UC疾病免疫反应影响的方面。