杭白芷根发育过程中香豆素类成分主要积累部位及含量变化研究

李博园,韩 敏，张明英，陈 莹

(1.陕西中医药大学 药学院，陕西 咸阳 712046；2.西安怡康医药连锁有限公司，陕西 西安 710000)

中药白芷为伞形科(Umbelliferae)植物[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm. )Benth. et Hook. f. ]或杭白芷[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm. )Benth. et Hook. f. var.formosana(Boiss. )Shan et Yuan]的干燥根，具祛风湿，活血排脓，生肌止痛等功效，是一味传统中药[1～2]。白芷药用化学成分主要有香豆素类、挥发油类以及黄酮类，其中香豆素类中的欧前胡素及异欧前胡素是白芷质量的主要控制成分，具有镇痛、解痉等作用[3～5]。目前对中药白芷的研究多集中在药理和化学成分[6～8]等方面，景汝勤等人研究了白芷根的组织分化[9]，但对其结构发育与药用成分积累关系研究较少[10]。欧前胡素在紫外波长下呈蓝色荧光，具有易溶于乙醇的性质[11]。因此，本研究以杭白芷根为研究对象，通过显微镜技术观察根的解剖结构，结合组织化学定位法以及植物化学方法，研究根中香豆素类药用成分的分布以及含量变化，旨在为进一步揭示杭白芷根的结构与药用成分的积累关系，为评价药材质量提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

杭白芷主根于2018年3-10月采自陕西中医药大学药用植物园栽培植株。

1.2 方法

1.2.1 石蜡切片法 选择不同时期生长正常健康的植株，将主根分割成0.5～1 cm长的小段，50%～70%乙醇FAA固定液固定一周、再进行脱水、包埋，之后切片，切片厚度8 ～10 μm，番红-固绿复合染色，中性树胶封藏，LEICA ICC50 W型显微镜观察并拍照。

1.2.2 组织化学定位法 取新鲜杭白芷主根中部，切成0.3～5 cm数个小段。取其中1小段冰冻切片，厚度30 μm，稀甘油封片后置于Leica DMBL荧光显微镜下，紫外光激发，观察并拍照。阴性对照:取1小段，置于70%乙醇FAA固定液中一周，再依次经过85%、95%、100%乙醇处理后，进行冰冻切片，切片厚度30 μm，于Leica DMBL荧光显微镜下观察并拍照。阳性对照：取欧前胡素为阳性对照，配制欧前胡素标准品溶液，将其滴加在载玻片上，制作临时装片，于Leica DMBL荧光显微镜下观察并拍照。重复实验3次。

1.2.3 数据统计 分别测量不同月份的杭白芷主根直径，统一测量位置为全长1/2处，再选取相对应位置FAA固定，按照“1.2.1”石蜡切片法进行切片染色，之后每个时期选取在同一倍数下的5个视野，进行分泌道数量的统计。

1.2.4 植物化学法 研究采用高效液相色谱法对杭白芷根中欧前胡素、异欧前胡素的含量进行提取测定[12]。

1.2.4.1 色谱条件与系统适应性实验。色谱条件：XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm,5μm)；流动相：乙腈-水(65：35)；检测波长：247 nm，流速：1.0 mL·min，柱温：30℃。

1.2.4.2 对照品溶液及供试品溶液的制备。精密称取欧前胡素1 mg，异欧前胡素0.6 mg，加流动相溶解并制成浓度分别为1 μg·mL-1和6μg·mL-1的溶液，作为对照品溶液；取不同时期的杭白芷粉末(过3号筛)各1.000 g，精密称定后置锥形瓶中，再加流动相40 mL，超声30 min，静置至室温过滤，滤液转移至50 mL容量瓶，加流动相定容，0.45 μm微孔滤膜过滤作为供试品溶液备用。

1.2.4.3 精密度实验及稳定性实验。取对照品溶液10 μL，进样5次，根据峰面积计算得欧前胡素、异欧前胡素的RSD分别为1.42%和1.05%，仪器精密度良好；取同一供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24 h进样，按上述色谱条件测定欧前素及异欧前胡素的峰面积，表明欧前胡素与异欧前胡素在24 h内基本稳定再根据测得的峰面积值计算RSD，RSD分别为1.37%和1.14%。

1.2.4.4 标准曲线的绘制。取对照品溶液，分别稀释1、3、5、8、10倍，分次进样，按上述色谱条件测定。结果欧前胡素在0.055 μg～0.555 μg范围内线性关系良好；异欧前胡素在0.033 μg～0.33 μg范围内线性关系良好。

1.2.4.5 样品含量测定。分别取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述高效液相色谱(HPLC)条件测得峰面积，并计算欧前胡素和异欧前胡素的含量。

1.2.4.6 重复性及加样回收率实验。取9月份杭白芷，照“1.2.4.2”项下方法制备供试品溶液5份，按上述色谱条件测定，欧前胡素、异欧前胡素的平均含量分别为0.097%和0.022%，RSD为0.89%，1.07%，表明该方法重现性良好；取9月份杭白芷粉末(过3号筛)约0.5 g，称定，分别加入已知浓度的对照品适量，照“1.2.4.2”项下方法制备供试品溶液后，各取10 μL注入液相色谱仪，测定，计算欧前胡素的平均加样回收率为99.4%，RSD为0.42%；异欧前胡素的平均加样回收率为98.9%，RSD为0.89%。

2 结果

2.1 根的结构发育特征

杭白芷根的次生结构由外向内依次包括周皮、形成层、次生韧皮部、次生木质部(图版Ⅰ，1)。次生结构开始形成以后，中柱鞘细胞不断分裂形成木栓形成层，木栓形成层进一步分裂，向内产生栓内层细胞，向外产生木栓层细胞，木栓形成层细胞较小且排列紧密，栓内层为排列较疏松单层薄壁细胞，木栓层细胞一般由5～8层，呈砖形、排列整齐的细胞构成(图版Ⅰ，2～3)。在木栓形成层形成早期，表皮细胞和初生皮层仍可见，之后随着周皮的产生和次生维管组织的增加逐渐脱落，周皮由木栓层、木栓形成层和栓内层细胞共同组成(图版Ⅰ，4)。周皮内侧为皮层薄壁细胞，其细胞近圆形，排列较疏松，有细胞间隙，皮层内可见体积较大的椭圆形分泌道分布，其次向内是次生韧皮部(图版Ⅰ，5)，最内侧为次生木质部(图版Ⅰ，6)。次生韧皮部由大量韧皮薄壁细胞和少量的筛管、伴胞组成，次生韧皮部中也可见数个类椭圆形的分泌道大致呈轮伞状分布，导管、木纤维、薄壁细胞、木射线等共同组成次生木质部(图版Ⅰ，7)，在次生木质部中，有大量的木薄壁组织细胞(图版Ⅰ，5～7)。维管射线由次生韧皮部横向发育出韧皮射线和次生木质部的木射线二者共同组成(图版Ⅰ，8)。

2.2 组织化学定位

荧光显微镜下观察杭白芷横切面可以看出，在紫外光激发下，导管及周皮有荧光现象，香豆素类的积累部位分泌道也有较明显的荧光出现(图版Ⅰ，9)，而其他部位无荧光出现，阴性对照除周皮和导管以外，其他部位无荧光，分泌道荧光消失(图版Ⅰ，10)，欧前胡素标准品的阳性对照中，欧前胡素发出的荧光与分泌道荧光一致(图版Ⅰ，11)。

2.3 统计结果

对不同时期杭白芷主根及根中分泌道进行观察，并统计了主根直径大小以及分泌道的数量。在表1中可以看出，整个发育过程中，根直径大小以及分泌道数量随着月份逐渐增长，9-10月后增长趋于平稳。

表1 杭白芷根直径大小以及分泌道数量统计结果

2.4 含量测定结果

以欧前胡素、异欧前胡素为评价指标(图1为对照品HPLC图，图2为样品HPLC图)，分别测得不同时期杭白芷根中药用成分的含量。图3为不同时期杭白芷根中欧前胡素含量积累的动态过程，可以看出杭白芷根中的欧前胡素含量在3-5月份先缓慢增加后下降至全年最低为0.127%，而后在5-7月逐渐上升，7-8月又出现回落，在8-9月迅速上升，达到全年最高为0.692%，之后又出现下降；图4为异欧前胡素含量积累的动态过程，异欧前胡素含量总体相比欧前胡素较低，可以看出3-7月处于上升趋势，7-8月出现下降，之后再逐渐增加；总含量为欧前胡素和异欧前胡素总和，在图5总含量的动态变化中可以看到，基本和欧前胡素变化趋势一致，在9月份达到全年最高为0.781%。

3 讨论

大多数伞形科植物中普遍存在分泌组织[13]。杭白芷根、茎以及叶中均有分泌道的存在[14～15]，本研究主要观察了根的解剖结构，次生结构主要由周皮、皮层、次生韧皮部、次生木质部所构成，在中柱鞘和次生韧皮部中可见分泌道分布其中[10]，中柱鞘薄壁组织中的分泌道体积较大，次生韧皮部中的分泌道较小，大致呈轮伞状分布，在北柴胡和狭叶柴胡中也有类似的现象[16～17]。在对不同时期根直径大小以及分泌道数量的统计结果中可以看出，随着根直径的增长，分泌道数量也逐渐增加，当根直径大小趋于稳定，分泌道数量也趋于稳定，结合组织化学定位结果，表明分泌道是香豆素类药用成分积累的主要部位，这与兰志琼等在白芷根中香豆素类成分的组织化学定位研究中表明，香豆素类成分主要分布于分泌组织内，结果基本一致[18～19]，因此分泌道的分布和数量可以作为评价杭白芷根中药用成分香豆素类含量的重要指标之一。

进一步通过高效液相色谱法对不同时期杭白芷根中主要药用成分欧前胡素以及异欧前胡素含量进行测定，结果表明，在杭白芷根的生长发育过程中，欧前胡素、异欧前胡素以及总含量呈”S”型曲线增长,在5-7月份欧前胡素和异欧前胡素处于明显上升期，在7-8月盛花期可能导致地下部分生长缓慢，含量下降，在9月份欧前胡素以及总含量达到全年最高，而在9-10月份分泌道数量较多，增长趋势平稳，因此进一步说明分泌道与香豆素类药用成分含量积累呈正相关，与药材质量关系紧密。