外加纤维素酶和α-淀粉酶对猪粪厌氧发酵的促进机制

黄 婧，肖艳春，陈 彪

福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建 福州 350003

据《中国统计年鉴》[1]数据显示，2017年底我国生猪存栏量为4.4×108头，年产生粪污约1.6×109t. 应用厌氧发酵技术处理畜禽粪便并实现资源化循环利用是目前公认最为有效的处理方式之一[2-3]，在获取能源物质的同时，可实现减少环境污染的目的[3-5]. 研究[6-7]表明，在厌氧发酵系统的水解、酸化、酸降和产甲烷阶段中，发酵底物的不同特性决定了厌氧发酵限速步骤的不同. 猪粪中主要的大分子复杂有机物是淀粉、蛋白质和纤维素，在厌氧发酵水解过程中糖类、蛋白质类物质优先被微生物利用[8-9]. 纤维素难以被微生物分解且其中的木质素不能被厌氧发酵过程中的微生物转化为沼气，需要在有氧条件下被降解，纤维素的不易降解性及淀粉类的不完全降解性限制其实际甲烷产率的提高[10]. 因此，水解反应成为猪粪厌氧发酵过程的限速步骤. 对厌氧发酵水解阶段反应条件的优化不仅可以缩短水解反应时间，还可以提高发酵原料甲烷产率，是研究学者关注的重点.

通过外加酶对发酵原料进行预处理以促进原料中有机物的水解是提高甲烷产率最为有效的方式之一. 酶具有分子量小、溶解度高、流动性好、比微生物更容易接近底物等优点，可以在一定条件下保持生物活性[11]. 目前，已有文献报道外源酶添加对厌氧发酵系统水解反应的影响效应及其积极作用. CHEN等[12]分析了外源水解酶对处理污泥的积极效应及影响，试验表明添加水解酶后污泥液相中SCOD (可溶性化学需氧量)增量显著. HE[10]研究显示，添加外源纤维素酶显著促进城市生活垃圾的厌氧发酵产沼，其有机组分纤维素水解率可达35.2%. 许美兰等[13]利用α-淀粉酶和蛋白酶构成的复合酶对猪粪进行处理后，SCOD提高了106.9%. YU等[14]研究发现，在污泥增溶酸化方面添加α-淀粉酶的效果优于添加蛋白酶或混合酶，污泥上清液中SCOD和VFA (挥发性脂肪酸)浓度分别提高了78.2%和129.6%. Ellenrieder等[15]采用机械和酶相结合的处理方式，对玉米和禾本科青贮饲料进行水解促使VFA浓度提高，并获得较高的沼气产气量. 上述研究主要关注外加酶对厌氧发酵过程中有机物水解产物的促进作用，关于联合投加纤维素酶和α-淀粉酶促进有机物厌氧发酵产甲烷过程中酶的添加量、添加比例及其相互作用的研究较为鲜见.

该研究采用序批式厌氧发酵方式，以猪粪为发酵原料，开展外源纤维素酶和α-淀粉酶对厌氧发酵影响的研究，从厌氧发酵水解和产酸阶段产物〔如多糖、TVFAs(乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的统称)等〕的变化规律角度，应用一级动力学模型和Gompertz模型拟合探析外源酶对厌氧发酵过程甲烷产率的影响效应，以期提高畜禽粪污等大分子有机废弃物厌氧发酵的生物产甲烷效率(BDA)，有效提升厌氧发酵技术应用水平.

1 材料与方法

1.1 试验材料和装置

鲜猪粪取自福建省某养殖公司，接种物取自常年正常运行的沼气工程厌氧发酵装置. 猪粪及接种物成分组成如表1所示. α-淀粉酶购自上海源叶生物科技有限公司，酶活 4 000 U/g；纤维素酶购自夏盛生物科技有限公司，酶活 10 000 U/g. 试验采用升流式厌氧污泥床(UASB)工艺，装置示意如图1所示.

1.2 试验方案及测定方法

表1 猪粪及接种物的成分

试验设置1个CK (对照)组、1个空白组和5个试验组，每组取猪粪 1 225 g，以未添加外源酶的处理为CK，以只添加接种物与蒸馏水的处理为空白组，各试验组外源酶添加量参照文献[13,16]，具体如表2所示. 各试验组先加入纤维素酶，搅拌均匀后在100 r/min、45 ℃恒温水浴摇床中振荡处理16 h，调节水浴摇床升温至50 ℃再加入α-淀粉酶振荡处理4 h，待冷却至常温后每组接入1 L的接种物，经调配后发酵料液总体积为5 L〔不足部分用蒸馏水补足，TS(总固体)含量约为8%〕，此时各试验组料液pH有略微差异，pH为7.0±0.1，料液通过蠕动泵导入UASB发酵装置，进料结束后向发酵装置中通N2保持10 min以保证厌氧环境，调节装置温度为35 ℃. 厌氧发酵过程中每日定时测定沼气产气量、φ(甲烷)及TVFAs浓度，在厌氧发酵前、后分别取样测定多糖浓度.

猪粪及接种物的TS、VS (挥发性固体)含量采用差重法测定[17]；C、H、O、N、S元素含量采用元素分析仪(Vario EL III，Elementar，德国)测定[18]；沼气日产气量使用湿式流量计(LML-1，长春汽车滤清器有限责任公司)测定；多糖浓度的测定采用苯酚-硫酸比色法[9]；沼气中φ(甲烷)和TVFAs浓度测定采用气相色谱法[19].

注：1—三相分离器；2—水封瓶；3—气体流量计；4—出水口；5—取样口；6—水泵；7—蠕动泵；8—恒温水浴箱；9—废水进水池.图1 UASB发酵装置示意Fig.1 Schematic drawing of the UASB fermentation reactor

表2 各组添加的酶量

1.3 数据分析

1.3.1发酵原料理论产甲烷潜力值

目前，发酵原料理论产甲烷潜力值的计算是通过分析物料中的C、H、O、N、S元素含量进行估算，碳水化合物、蛋白质等有机物用CxHyOzNnSs表示，若完全生物降解转换为CH4和CO2，其降解过程可用式(1)估算发酵原料的理论产甲烷潜力值(Xe)[20-21]. 该研究中的甲烷产率是基于猪粪中VS含量计算.

(1)

式中：Xe为发酵原料的理论产甲烷潜力值，mL/g；x、y、z、n、s分别为发酵原料C、H、O、N、S元素含量与C、H、O、N、S元素相对原子质量的比值(取整数).

1.3.2发酵底物产甲烷动力学

应用一级动力学模型和Gompertz模型拟合厌氧发酵过程并计算动力学反应常数[22]，根据决定系数R2对模型的拟合度进行比较.

一级动力学模型：

Xt=X∞[1-exp(-kt)]

(2)

式中：Xt为t时刻猪粪甲烷产率，mL/g；X∞为整个发酵周期内猪粪甲烷产率，mL/g；k为反应速率常数，d-1.

Gompertz模型[23]：

(3)

式中：Rm为产甲烷速率，mL/(g·d)；λ为迟滞时间，d.

1.3.3发酵底物生物产甲烷效率

以不同时段甲烷累积产量与整个发酵周期甲烷总产量的比值表示发酵过程甲烷产率比(MPR)[24]. 以厌氧发酵不同时间点实际甲烷产率与理论甲烷产率的比值表示底物的生物产甲烷效率(BDA)，计算公式[24]：

BDA=(Xt/Xe)×100%

(4)

1.3.4数据处理

采用SPSS 19.0软件进行数据处理及方差分析(不同试验组之间的多重比较采用LSD法)，采用Origin 9.1软件进行绘图及方程拟合. 对照组和试验组的沼气产气量、φ(甲烷)和TVFAs浓度的试验数据取3次重复试验的平均值.

2 结果与讨论

2.1 纤维素酶与α-淀粉酶配比对多糖的影响

由图2可见，与CK组相比，经酶处理后(即厌氧发酵前)各试验组发酵底物中的多糖浓度均有提高(P<0.05)，多糖浓度最大值(4 917 mg/L)出现在纤维素酶与α-淀粉酶配比为0∶1的试验组，其次出现在纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3的试验组(4 494 mg/L)，分别比CK组增加了196.0%、171.0%，表明在总添加量一定的条件下，多糖浓度与α-淀粉酶的添加量成正比. 已有研究[25]表明，在底物浓度一定的条件下，酶浓度较低时酶促反应速率与酶浓度成正比，随酶浓度的增加酶促反应速度达到最大值，这时反应体系中的酶已全部和底物结合成中间产物，如再增加酶对酶促反应速率影响不大. 研究[26-27]发现，猪粪干物质中碳水化合物占比为19.9%～34.7%，纤维素、半纤维素和木质素占比为8.9%～18.8%，发酵底物中淀粉含量高于纤维素. 结果表明，当两种酶的总添加量为40 mg/g时，纤维素酶的添加阈值为10 mg/g. 唐治等[16]发现，外加纤维素酶促进剩余污泥水解的最适投加量为20 mg/g，最适纤维素酶添加量的不同是发酵底物的元素组成不同导致的. 厌氧发酵后各试验组的多糖浓度均低于CK组(P<0.01)，多糖浓度最小值(586 mg/L)出现在纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3的试验组，仅为CK组的55.4%. 在两种酶总添加量为40 mg/g时，α-淀粉酶的添加阈值为30 mg/g. 许美兰等[13]发现，当α-淀粉酶的添加量超过30 mg/g时，酶促水解效应下降，与该研究结果一致. YANG等[21]发现，蛋白酶和淀粉酶的添加量与SCOD/TCOD(溶解性化学需氧量与总化学需氧量之间的比值，下同)、VSS (挥发性悬浮固体)的降解率均成正比，达到平衡时复合酶的加入剂量为6%. 综上，纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3时对发酵底物的生物质降解效果最佳.

图2 不同纤维素酶与α-淀粉酶配比对多糖浓度变化的影响Fig.2 The effect of different ratio of cellulase and α-amylase to variations of polysaccharide content

2.2 纤维素酶与α-淀粉酶配比对TVFAs的影响

图3 不同纤维素酶与α-淀粉酶配比对TVFAs浓度变化的影响Fig.3 The effect of different ratio of cellulase and α-amylase to variations of TVFAs concentration

厌氧发酵过程各试验组TVFAs浓度变化如图3所示. 由图3可见，各试验组与CK组的变化规律一致，均呈先升后降，最后趋于平稳的特征. CK组在第3天达到产酸高峰(TVFAs浓度为 7 030 mg/L). 纤维素酶与α-淀粉酶配比为0∶1、1∶1、1∶3的试验组均比CK组提前1 d达到产酸高峰，其中，配比为0∶1试验组的产酸峰值最大(8 986 mg/L)，比CK组提高了27.8%；其次是配比为1∶3的试验组(8 666 mg/L)，比CK组提高了23.3%. 在发酵前5 d，各试验组TVFAs浓度与多糖浓度的变化规律一致，产酸峰值与CK组相比均有提高(P<0.05)，这是由于前期添加的酶促进了有机物水解，厌氧发酵系统中多糖浓度增加，水解产生的多糖等小分子有机物被产酸细菌吸收至胞体内进行代谢转化，产生以短链脂肪酸为主的简单有机物并分泌到胞外[28]，系统中的短链脂肪酸(即TVFAs)浓度随之增加，因此TVFAs浓度与多糖浓度成正比.

随着厌氧发酵过程的进行，各试验组在20 d后进入稳定期，至发酵结束各试验组的TVFAs累积量均低于CK组，TVFAs累积量依次为1∶3试验组<1∶1试验组<0∶1试验组<3∶1试验组<1∶0试验组

在发酵起始阶段纤维素酶与α-淀粉酶配比为0∶1 时的产酸高峰比配比为1∶3时略高，但在厌氧发酵结束时，配比为0∶1的TVFAs累积量反而高于配比为1∶3的累积量，该结果与2.1节中厌氧发酵前后多糖浓度的变化规律一致. 当配比为0∶1时，虽然C/N提高了，但其有机物水解速率过快且大于产甲烷速率，导致TVFAs有一定积累；当配比为1∶3时，C/N适合厌氧发酵系统中微生物菌群的需求，其水解速率与产甲烷速率达到较佳的平衡状态. 综上，纤维素酶与α-淀粉酶的最佳配比为1∶3.

2.3 纤维素酶与α-淀粉酶配比对沼气产气量的影响

由图4可见：在厌氧发酵进程中，沼气日产气量总体呈先升后降的趋势，CK组产气高峰分别出现在第4天、第9天、第16天；除纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3的试验组在第6天出现1个产气高峰外(峰值期比CK组提前3 d)，其他试验组均出现3个产气高峰(峰值期比CK组提前1～2 d)，这与相关研究结果[3]一致. 纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3的试验组日产气峰值最大(14 090 mL)，比CK组(11 710 mL)增加了20.3%.

图4 不同纤维素酶与α-淀粉酶配比对沼气日产气量变化的影响Fig.4 The effect of different ratio of cellulase and α-amylase to variation of daily biogas production

2.2节分析显示，酶对各试验组的TVFAs峰值有促进作用，各试验组TVFAs产酸高峰的提前到达促使沼气日产气量峰值的提前到达，TVFAs浓度的提高促进了产甲烷路径中合成甲烷前体物质(包括乙酸及CO2、H2等)浓度的提升，水解产酸阶段时间缩短，接种物及发酵体系中的产甲烷菌将TVFAs较快地转化为甲烷，使其较快达到产气峰值. 各试验组沼气产气峰值均高于CK组，而后产气速率下降，并接着出现下一个产气高峰，这是因为容易降解的底物被消耗后，水解性细菌不得不利用较难降解的纤维素等物质[7]，但发酵原料中可降解的纤维素含量低于淀粉含量，因此后期产气峰值不如前期. 纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3的试验组只在前期出现1个产气高峰，这是由于添加的纤维素酶在厌氧发酵前就已将物料中可降解的大部分纤维素降解. WANG等[11]使用牛粪和玉米秸秆共同厌氧发酵时，通过添加水解酶使其日产气量峰值期提前. 因此，沼气日产气量变化与TVFAs浓度变化呈显著正相关[31]，酶活性与水解产酸时间呈负相关[19]，纤维素酶和α-淀粉酶的适量添加有利于沼气产气峰值的提前到达及产气速率的提高.

图5反映了各试验组的累积沼气产气量变化规律，各试验组间累积沼气产气量差异显著(P<0.01). 由图5可见：纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3的试验组累积沼气产气量最大(187 688 mL)，比累积沼气产气量最小的CK组(151 930 mL)提高了23.5%；配比为3∶1、1∶0试验组的累积沼气产气量分别比CK组分别提高了11.3%、7.3%. 结果表明：添加纤维素酶与α-淀粉酶对累积沼气产气量有不同程度的促进作用，其中，两种酶单独投加均能促进累积沼气产气量的提高，单一添加α-淀粉酶比单一添加纤维素酶的促进效果显著；添加两种酶比添加单一酶的促进效果显著，当纤维素酶与α-淀粉酶配比由1∶3逐步提至3∶1 时，其累积产气量反而下降.

图5 不同纤维素酶与α-淀粉酶配比对累积沼气产气量的影响Fig.5 The effect of different ratio of cellulase and α-amylase to cumulative amount of biogas production

李建昌等[7]通过添加α-淀粉酶和γ-淀粉酶对猪粪进行预处理，采用玻璃试剂瓶作为厌氧发酵装置使累积产气量提高了14.71%，而单一添加α-淀粉酶使累积产气量提高了14.09%，两种淀粉酶的复合增效作用并不显著，可能与这两种酶均属于同质性酶类且采用的厌氧发酵工艺不同有关. LUO等[32]发现，α-淀粉酶在污泥水解过程的水解常数随温度(在40～70 ℃之间)升高而增大，50 ℃时的水解过程符合一级动力学模型且动力学常数值最大. HE[10]研究纤维素酶预处理城市生活垃圾发现，与产气相关的系数相对空白可提高75.08%. 该研究中累积沼气产气量有大幅提升，与试验中增加了水解酶的种类、降低了酶的作用温度、延长了酶的作用时间以及采用UASB厌氧发酵工艺有关. 许美兰等[13]利用淀粉酶和蛋白酶两种复合酶对猪粪进行预处理发现，经复合酶处理的试验组与对照组相比，SCOD提高了106.9%. SCOD包含了酶催化反应过程中的中间产物及终产物，用该指标表征两种酶复合增效显著，复合酶的较佳水解温度和时间分别为45 ℃、6 h，该试验也进一步验证了酶种类、作用温度对水解过程起着重要作用，适宜条件对沼气产气量促进效应显著.

2.4 动力学分析

2.4.1配比对甲烷产率的影响

图6为沼气中φ(甲烷)变化曲线图，φ(甲烷)的变化是厌氧发酵不同阶段中非产甲烷菌与产甲烷菌之间相互平衡协同作用的结果. 由图6可见：在厌氧发酵进程中，各试验组φ(甲烷)均呈先快速增加而后趋于稳定，末期逐步降低的特征. CK组的φ(甲烷)稳定期为23 d (第4～26天)，φ(甲烷)稳定在60.4%～70.4%之间；纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3 试验组在厌氧发酵周期内的φ(甲烷)平均值最佳，稳定期为27 d (第3～29天)，稳定期长于CK组，φ(甲烷)稳定在61.7%～70.8%之间，比CK组略有增加. 试验组添加的酶使厌氧发酵系统中可利用的碳源物质增加，促使TVFAs和pH发生变化，提高了系统运行的稳定性，乙酸产甲烷途径、氢还原CO2产甲烷途径中碳物质浓度随之增加，乙酸作为甲烷形成的重要前体物质[33]，其含量的提高促进了终产物甲烷含量的提升.

图6 不同纤维素酶与α-淀粉酶配比对沼气中φ(甲烷)变化的影响Fig.6 The effect of different ratio of cellulase and α-amylase to variation of methane volume fraction in biogas

由表3可见：CK组的甲烷产率为315.4 mL/g，与杜连柱等[24]研究结果(326 mL/g)相近. 纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3时甲烷产率最高(392.1 mL/g)，比CK组提高了24.3%；两种酶比单一酶处理的甲烷产率有所增加，相较CK组，配比为1∶3时比配比为1∶0 时的甲烷产率(336.9 mL/g)增加了17.5%；单一α-淀粉酶处理(配比为0∶1)的甲烷产率比单一纤维素酶处理(配比为1∶0)增加了10.1%.

各试验组甲烷产率差异性主要原因是：①猪粪中淀粉含量比纤维素高，所以单一α-淀粉酶处理比单一纤维素酶处理的甲烷产率高；②两种酶比单一酶处理的甲烷产率高，猪粪中的纤维素是难降解物质，先采用外加纤维素酶进行预处理，使发酵原料在有氧环境中水解，有利于促进水解反应的发生及水解时间的缩短，而且纤维素酶中的β-葡萄糖苷酶并非专一性酶，其可以作用于发酵原料中的β-1，4-糖苷键，提高水解效率，两种酶联合水解过程中产生的寡糖、纤维二糖、麦芽糖、糊精等中间产物，增加了可利用碳源的浓度，为可以利用低聚糖的微生物提供更多的营养物质和能源，促进产氢产乙酸微生物的生长繁殖并在较短时间内将低分子糖类转化为乙酸，产甲烷菌可以更高效、快速地将乙酸转化为甲烷，促进甲烷产率提高；③α-淀粉酶添加量超过30 mg/g时，甲烷产率反而下降(配比为0∶1试验组比1∶3试验组的甲烷产率低)，当添加的α-淀粉酶超过一定量时可能导致过快的有机物水解及后续过快的有机酸产生，一旦有机酸产生速率超过产甲烷菌进行甲烷转化的速率，有机酸的过量积累将抑制产甲烷菌的活性，最终导致甲烷产率的下降；④纤维素酶添加量超过10 mg/g时，甲烷产率反而下降(配比为1∶1试验组较1∶3试验组的甲烷产率低)，这是由于随着纤维素酶活的增加，水解产物纤维二糖的浓度逐渐升高，当纤维二糖的浓度超过临界值则会产生反馈抑制，抑制纤维素酶的酶活[34-35]，水解反应速率减缓，水解产物减少，相应的甲烷产率降低. 综上，纤维素酶与α-淀粉酶的添加量及添加比例对甲烷产率的提高尤为重要.

2.4.2甲烷产率动力学模型

试验采用一级动力学模型和Gompertz模型拟合不同试验组的厌氧发酵产甲烷过程，表3中列出了两种模型的拟合参数.

由表3可见，Gompertz模型的决定系数R2均大于 0.997 8，拟合精确度高，而且甲烷产率的拟合值与实测值接近，最大差值仅为-1.8%，说明该模型可以较为准确地反映各试验组产甲烷过程. 一级动力学模型的决定系数R2均小于 0.970 3，且拟合值与实测值偏差超过24.0%，说明不适合用该模型拟合厌氧发酵过程.

表3 拟合方程对各试验组甲烷产率曲线的拟合结果

Gompertz模型中，CK组的迟滞期最长(2.29 d)，纤维素酶与α-淀粉酶配比为0∶1试验组的迟滞期最短(1.08 d)，比CK组缩短了52.8%；纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3试验组的迟滞期次之(1.41 d)，比CK组缩短了38.4%，进一步验证了上述水解阶段多糖浓度的变化规律，在总添加量一定的条件下，随着α-淀粉酶添加量的增加，迟滞期随之缩短. 该试验结果是由于添加的酶促进物料中颗粒有机物水解为小分子，产生更多的表面积供微生物附着，而且随着酶浓度和吸附位点可用性的增加而增加[32]，产氢产乙酸菌的数量急剧增多，物料中α-淀粉酶作用专一性位点数量相对较多，α-淀粉酶的水解速率优于纤维素酶. CK组的反应速率最慢〔26.18 mL/(g·d)〕，纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3试验的反应速率最快〔32.95 mL/(g·d)〕，比CK组提高了25.8%. 因此，α-淀粉酶和纤维素酶的添加不仅缩短了迟滞期，还提高了反应速率，其中纤维素酶与α-淀粉酶的最佳配比为1∶3.

研究[22,26]发现，对不同有机废弃物的厌氧发酵过程进行动力学分析，Gompertz模型可以较好地反映各原料的产甲烷过程. 而徐文倩等[36]研究发现，在一定条件下，接种比越大，含固率越高，一级动力学模型的拟合度越高. 杜连柱等[24]发现，一级动力学模型可以较好地拟合TS含量为3%和7.5%时的厌氧发酵过程. 因此，在TS含量较低时，接种物与发酵原料的比值大于3∶1时采用一级动力学模型可以较好地拟合厌氧发酵过程，其他条件下的厌氧发酵过程则较适宜采用Gompertz模型进行拟合.

2.4.3纤维素酶与α-淀粉酶协同效应分析

纤维素酶与α-淀粉酶不同配比协同效应如表4所示. 实测值为各试验组实际甲烷产率，预测值是基于0∶1试验组与1∶0试验组的实测值，并按纤维素酶与α-淀粉酶不同配比计算得出的甲烷产率[37]. 由表4可见，不同纤维素酶与α-淀粉酶配比存在不同程度的协同效应，当纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3时，两种酶协同效应显著，增率为8.4%.

表4 不同纤维素酶与α-淀粉酶配比协同效应分析

2.5 纤维素酶与α-淀粉酶配比对生物产甲烷效率的影响

各试验组厌氧发酵过程部分时间点的MPR和BDA如表5所示，其可作为确定HRT(水力停留时间)的重要依据. 该研究中以MPR等于90%表示厌氧发酵反应过程结束[24]. 由表5可见，CK组和各试验组的厌氧发酵结束时间分别为17.9、15.8、16.5、16.3、15.4和16.8 d，纤维素酶与α-淀粉酶配比1∶3试验组的HRT时间最短，比CK组缩短了2.5 d. 在实际应用中，HRT的缩短意味着发酵反应器有更高的有效容积利用率，利于成本降低.

根据发酵原料元素分析结果可知，猪粪的化学组成为C270H485O141N18S2，通过式(1)计算得出猪粪的理论产甲烷潜力值为552.3 mL/g，由此计算原料在不同发酵时间的BDA(见表5)，该值为衡量原料甲烷转化是否彻底的重要参数. 适量添加α-淀粉酶或纤维素酶有明显的促进作用. 反应结束时，纤维素酶与α-淀粉酶配比为0∶1、1∶0试验组的BDA值与CK组相比分别提高了16.9%、6.8%，说明添加单一α-淀粉酶对厌氧发酵过程生物质转化效率的影响比添加单一纤维素酶更为显著，这是由于猪粪中的纤维素属于结构性碳水化合物，不容易被降解. 研究[38]发现，厌氧发酵水解过程中纤维素一级动力学水解常数为0.011～0.0139 d-1，而碳水化合物一级动力学水解常数为0.025～0.200 d-1，纤维素水解常数比碳水化合物低，水解速率慢，虽然添加了纤维素酶促进纤维素水解，但发酵原料中纤维素的含量也低于碳水化合物含量，降解底物有限，相应的BDA值较低. 纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3的试验组在第13天的BDA值已超过CK组第35天的值，在第35天时其BDA值为71.0%，较CK组提高了24.3%，说明两种酶协同效应显著.

表5 厌氧发酵过程部分时间点的甲烷产率比和生物产甲烷效率

3 结论

a) 采用UASB厌氧发酵产沼装置，适量添加的纤维素酶和α-淀粉酶对猪粪进行预处理有利于促进有机物的水解. 在pH为7.0、温度为35 ℃下厌氧发酵，水解阶段的多糖浓度与产酸阶段的TVFAs浓度变化规律一致. 两种酶总添加量为40 mg/g，且α-淀粉酶添加量不超过30 mg/g时，α-淀粉酶添加量与甲烷产率呈正相关；当纤维素酶添加量超过10 mg/g 时，纤维素酶添加量与甲烷产率呈负相关.

b) 甲烷产率与多糖浓度、TVFAs浓度的变化规律有一定的相关性，但也存在差异性. 纤维素酶与α-淀粉酶配比为1∶3的试验组，其水解速率与产甲烷速率达到较佳的平衡状态，最早达到产气高峰(第6天)，甲烷产率最高(392.1 mL/g)，且生物产甲烷效率最佳(71.0%)，HRT最短(15.4 d)，两种酶协同效应显著.

c) 该研究尚未考虑pH和温度对外加酶促进厌氧发酵产沼气的影响，后续可进一步开展相关研究.