不同碳氮比对海水养殖废水脱氮效果的影响

郑冰冰，吴怡伟，李云辉，周弋铃，王欣雨，赵阳国

中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100

我国是水产养殖大国，2016年海产品总产量达 3 490.15×104t，占世界海产品总量的33.95%，可提供动物性蛋白质266.21×104t，满足了人们对优质蛋白不断增长的需求[1]. 海水养殖过程中投加的大量固体饵料等最终会分解成含硫、氮等污染物[2]. 海水养殖废水中ρ(NO3--N)、ρ(NO2--N)、ρ(NH4+-N)和ρ(CODCr)分别为0.06～15.7、0.01～3.7、1.2～4.5和10～145 mg/L，C/N (碳氮比)变化较大[3]. 含氮废水不仅污染受纳水体、影响水生生物的健康，还对海洋生态的威胁越来越大[4]，因此海水养殖废水的脱氮处理尤为重要. 根据理论计算，海水养殖废水处理过程中，能够通过全程硝化反硝化方式实现生物脱氮的最低C/N为5[5]，碳源不足是导致脱氮无法完成的关键因素. 生物完全脱氮过程包括有机氮矿化、氨氧化、亚硝态氮氧化、硝态氮还原、亚硝态氮还原等一系列过程，是由自养菌和异养菌协作完成的. 然而，处理低C/N海水养殖废水时，在碳源匮乏压力下，反应器处理效果、生物膜中的EPS (胞外聚合物)状态、脱氮环节中一系列酶促反应的敏感性仍需进一步分析.

已有学者研发了针对海水养殖废水处理的工艺系统，并取得了较好的效果. 费翔等[6]研究表明，A/O 工艺适用于处理流量大、盐度高而营养盐含量低的海水养殖废水. MBBR (移动床生物膜反应器)具有在低C/N下处理效果稳定、不易发生堵塞、抗冲击负荷能力较强、无污泥膨胀等一系列优势[7-8]. A/O-MBBR (缺氧/好氧-移动床生物膜反应器)工艺结合了A/O工艺高效脱氮和MBBR工艺高生物量的优势，在海水养殖废水处理中表现出很好的应用前景.

该研究采用A/O-MBBR工艺处理模拟海水养殖废水，通过降低模拟废水中碳源含量，分析低C/N下其对废水的处理效果，并对EPS成分及硝化反硝化酶活性进行分析，探究低C/N影响A/O-MBBR工艺脱氮的机制，以期为海水养殖废水高效脱氮处理提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 反应器启动与运行

A/O-MBBR反应器(见图1)材料为有机玻璃，有效容积为11.88 L. 反应器通过隔板分为缺氧区、好氧区和沉淀区，缺氧区内装有搅拌装置，好氧区内设挡板和曝气管. 其中，缺氧区和好氧区各填有1/3体积的PP材料制成的K3填料，直径为25 mm，有效表面积>500 m2/m3. 缺氧区的尺寸为10 cm×10 cm×30 cm，体积为3 L；好氧区的尺寸为10 cm×36 cm×27 cm，体积为9.72 L；沉淀区在好氧区内部，尺寸为5 cm×12 cm×14 cm，体积为0.84 L.

注：1—进水桶； 2—进水泵； 3—缺氧区； 4—搅拌装置； 5—好氧区； 6—回流泵； 7—曝气泵； 8—曝气管； 9—沉淀区； 10—出水桶； 11—填料. 图1 A/O-MBBR反应器的示意Fig.1 The schematic diagram of A/O-MBBR reactor

反应器处理废水时，进水首先与好氧区的回流硝化液混合，使用蠕动泵将混合液泵入缺氧区，在缺氧区中与填料充分接触完成反硝化反应；通过溢流堰进入好氧区，在好氧区中与挂膜填料一起流动完成硝化过程，硝化液通过回流泵进入缺氧区，部分出水溢流至沉淀区；在沉淀区，上清液通过出水口排出.

根据文献[9]中海水养殖废水成分〔ρ(NH4Cl)为18.00 mg/L、ρ(NaNO3)为30.00 mg/L、ρ(NaNO2)为3.30 mg/L、ρ(KH2PO4)为15.00 mg/L、ρ(CH3COONa)为159.00 mg/L、ρ(Na2CO3)为130.00 mg/L〕，自行配制模拟废水. 反应器启动接种污泥取自青岛团岛污水处理厂二沉池及胶州湾底泥，加入模拟废水后，控制A/O-MBBR反应器中ρ(MLSS)(MLSS为混合液悬浮固体浓度)在2.00 g/L左右. 采用序批式进水方式启动反应器，前4周进水各组分浓度分别为模拟养殖废水水质的0.25、0.50、0.75和1.00倍，第5周开始连续进水，废水成分不再变化. 反应器启动完成后，保持ρ(TN)不变，盐度稳定在30‰，调节pH在6.8～7.2之间，逐渐降低进水中CH3COONa浓度，使C/N由启动完成时的12依次降为6、5、4、3、2、1. 每个条件运行时间为7 d，整个运行阶段中环境温度约为20 ℃.

1.2 检测及分析方法

1.2.1水质检测和分析

每天监测进、出水中各组分浓度，ρ(CODCr)、ρ(NH4+-N)、ρ(NO3--N)、ρ(NO2--N)分别采用重铬酸钾法、纳氏试剂分光光度法、紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法[10]测定；进水中未添加有机氮，ρ(TN)等于ρ(NH4+-N)、ρ(NO3--N)、ρ(NO2--N)之和.

每天监测缺氧区和好氧区中ρ(DO)、pH，其中ρ(DO)采用便携式溶解氧分析仪(HACH-HQ30d，美国哈希公司)测定，pH采用精密pH计(E-201-C，上海雷磁仪器有限公司)测定.

1.2.2EPS分析

在每个条件结束时，参照文献[11]的方法取反应器缺氧区(A)和好氧区(O)载体生物膜样品，根据C/N依次编号为A12、A6、A5、A4、A3、A2、A1和O12、O6、O5、O4、O3、O2、O1.

参照文献[12]的方法，对EPS进行提取和分析. 用50 mL离心管取混合均匀的生物膜样品30 mL在2 000×g离心力下离心10 min，弃去上清液后原转速和时间洗涤3次. 80 ℃下热提10 min后再次离心，得到的上清液即为提取到的EPS. EPS含量通过蛋白质和多糖来表征. 其中，蛋白质含量采用改进后的Folin-酚试剂法测定，以牛血清白蛋白为标准品；多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，以葡萄糖为标准品.

EPS三维荧光光谱(3D-EEM)采用荧光分光光度计(F-4600, Hitachi, 日本)进行测定. λEx(激发波长)范围为200～400 nm，扫描间隔为5 nm；λEm(发射波长)范围为200～500 nm，扫描间隔为5 nm；发射光与激发光的狭缝均设置为5 nm，扫描速率为 1 200 nm/min. 光谱图采用Origin 2017软件进行绘制，按照表1[13]进行分区，参照区域积分方法(fluorescence regional integration，简称FRI)[14]将荧光光谱所代表区域内的荧光强度进行积分，获得区域积分值，用于解析三维荧光光谱图.

表1 5个荧光积分区域[13]

1.2.3酶活性分析

参照文献[15]的方法处理生物膜样品、提取粗酶液并分析其活性. 取出一定体积生物膜，用0.01 mol/L的磷酸缓冲液(pH=7.4)冲洗3次；将生物膜溶液在4 ℃、20 kHz的声波下处理3 min以打碎生物膜中的细胞结构. 然后将样品置于4 ℃、7 000×g离心力下离心10 min，上清液即为提取到的粗酶液，用于氨单加氧酶(AMO)、亚硝酸盐氧化酶(NOR)、亚硝酸盐还原酶(NIR)、硝酸盐还原酶(NR)活性及蛋白质含量的测定. 按照文献[16]的方法分别配制4种培养液，置于摇床中在30 ℃、150 r/min条件下培养一定时间后测定ρ(NO2--N)变化，以培养液中单位时间单位质量蛋白质产生或消耗的NO2--N表示酶活性，即μg/(min·mg)(以NO2--N计，下同).

2 结果与分析

2.1 降低C/N对反应器运行效能的影响

图2为反应器运行期间进、出水CODCr、NO3--N、NH4+-N、NO2--N、TN质量浓度及其去除率变化情况. 由图2可见：①C/N为12时，CODCr平均去除率为98.32%，出水ρ(CODCr)在1.00 mg/L以下；当C/N降至1时，CODCr平均去除率为92.44%，出水ρ(CODCr)平均值为0.80 mg/L；C/N降低过程对反应器去除CODCr无影响. ②降低C/N对反应器去除NO3--N的影响较大. 随着C/N降低，出水ρ(NO3--N)逐渐升高. C/N为12时，NO3--N去除效果最好，出水ρ(NO3--N)平均值为0.45 mg/L，去除率在90%以上；C/N降至5时，ρ(NO3--N)开始出现积累，随着C/N持续降低，积累情况继续加重；C/N为1时，出水ρ(NO3--N)平均值高达10.95 mg/L. ③C/N为12时，NH4+-N的去除率在90%以上，出水ρ(NH4+-N)平均值为0.44 mg/L；C/N由12降至1过程中，NH4+-N的去除率未受到太大冲击；C/N为1时，出水ρ(NH4+-N)平均值为0.22 mg/L. ④C/N对反应器去除NO2--N的影响较小，但NO2--N的去除需要更久的稳定时间，所以C/N由12降至1过程中NO2--N去除率波动较大，但在试验后期其去除率达到相对稳定状态，出水ρ(NO2--N)在0.12 mg/L左右. ⑤降低C/N对反应器去除TN影响较大. 随着C/N降低，出水ρ(TN)逐渐升高；进水C/N 为12时，TN去除效果最好，出水ρ(TN)平均值为0.98 mg/L，其去除率在90%以上；随着C/N的降低，TN去除率降低，在C/N降为3后，反应器脱氮功能逐渐衰退，出水与进水ρ(TN)相近；C/N为1时，出水ρ(TN)平均值高达11.34 mg/L.

图2 C/N对CODCr、NO3--N、NH4+-N、NO2--N、TN去除效果的影响Fig.2 Effects of C/N on the removal of CODCr, NO3--N, NH4+-N, NO2--N and TN

图3为反应器运行期间ρ(DO)和pH变化情况. 由图3可见：好氧区ρ(DO)起初波动较大，然后逐渐稳定在8.50 mg/L左右；C/N由12降至5的过程中缺氧区ρ(DO)较低(<0.50 mg/L)，C/N为4时，ρ(DO)开始升高，当C/N为1时达2.00 mg/L；随着C/N的降低，缺氧区pH逐渐降低，C/N为12时pH平均值为7.70，C/N为1时pH平均值为7.19；C/N由12降至6后好氧区pH出现较大波动，降至5后逐渐稳定，整个运行期间好氧区平均pH为7.94.

图3 反应器运行期间ρ(DO)和pH的变化情况Fig.3 Changes of ρ(DO) and pH during reactor operation

2.2 不同C/N对生物膜中EPS含量及其组分的影响

微生物EPS中蛋白质和多糖的含量变化如图4所示. 由图4可见，随着C/N的降低，EPS含量逐渐降低，C/N为1时EPS含量比C/N为6时降低了47%. EPS中蛋白质含量明显降低，C/N由6降至3的过程中，C/N变化对缺氧区中细胞分泌蛋白质的过程影响更大；C/N由3降至1的过程中，C/N的降低对缺氧区和好氧区中细胞分泌蛋白质的过程影响减小. 随着C/N的降低，缺氧区和好氧区微生物EPS中多糖含量出现不同变化趋势. 缺氧区中多糖含量随着C/N降低呈现先降后升的趋势，C/N为2时多糖含量最低；好氧区中多糖含量呈现先升后降的趋势，C/N 为3时多糖含量最高.

图4 C/N对单位质量生物膜EPS中蛋白质和多糖含量的影响Fig.4 Effects of C/N on protein and polysaccharide content in extracellular polymers of biofilm per unit mass

图5为生物膜EPS三维荧光光谱图. EPS包括色氨酸蛋白类、酪氨酸蛋白类、腐殖酸类、富里酸类及溶解性的微生物产物等，通过计算得到不同进水C/N对应的EPS各分区荧光强度占比(见表2). 由表2可见：在反应器运行过程中，生物膜EPS中色氨酸蛋白类和溶解性微生物代谢产物占比较高；随着进水C/N的降低，在反应器的缺氧区生物膜EPS中，酪氨酸蛋白类、色氨酸蛋白类和富里酸类物质的占比升高，溶解性微生物代谢产物的占比降低，腐殖酸类物质占比先降后升；好氧区生物膜EPS中，酪氨酸蛋白类和富里酸类物质的占比升高，色氨酸蛋白类和腐殖酸类物质占比出现较小波动，溶解性微生物代谢产物占比降低.

2.3 降低C/N对微生物酶活性的影响

在C/N逐渐降低的过程中，反应器中和脱氮相关的微生物酶的活性变化见图6. 由图6可见：在反应器的运行周期内，NIR和NR活性随C/N降低而降低，C/N的降低对NR活性影响更大，对硝酸盐还原菌表现出更明显的抑制作用；AMO和NOR活性均出现先减后增的趋势，C/N的降低对AMO、NOR活性的影响较小，对氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌未表现抑制作用.

表2 不同C/N下反应器缺氧区、好氧区生物膜EPS中各组分占比

图6 C/N对NIR和NR、AMO和NOR的影响Fig.6 Effects of C/N on nitrite reductase (NIR) and nitrate reductase (NR),ammonia monooxygenase (AMO) and nitrite oxidase (NOR)

3 讨论

硝化反应是将NH4+-N氧化为NO2--N并进一步氧化为NO3--N的过程，该过程一般由自养型好氧微生物在好氧区完成，反应过程中硝化菌以O2为电子受体，从NH4+-N和NO2--N的氧化反应中获得能量. 该研究中，NH4+-N和NO2--N的去除未受到C/N降低的影响，C/N为1时，出水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分别为0.22和0.12 mg/L(见图2)，硝化反应中AMO和NOR活性随着C/N的降低有升高趋势(见图6). 反应器好氧区曝气充足，ρ(DO)在8.5 mg/L左右(见图3)，大量的O2可为硝化反应提供充足的电子受体，使硝化菌顺利完成硝化反应. 研究[17-18]表明，碳源的减少不会对硝化反应产生较大影响，低C/N对反应器去除CODCr、NH4+-N、NO2--N的影响较小，碳源的减少不会抑制硝化反应，这与该研究结果一致.

反硝化是将NO3--N还原为NO2--N并进一步还原为N2的过程，该过程一般是异养型兼性反硝化菌在ρ(DO)较低的缺氧区完成，反硝化菌以硝酸盐和亚硝酸盐中的氮为电子受体，从电子供体(有机碳)的氧化反应中获得能量. 该试验中，C/N由6降为5后NO3--N去除率降低，出水中NO3--N在第4天开始出现积累；随着C/N由5逐渐降低，NO3--N的积累程度也越来越严重(见图2)，但是在整个运行过程中NO2--N没有出现积累现象. 反硝化中NR活性随C/N 降低受到明显抑制，而NIR活性受影响较小(见图6)；同时缺氧区pH的降低(见图3)也说明反硝化速率的降低. 研究表明，当外碳源不足时，反硝化菌会消耗内碳源聚-β-羟丁酸(PHB)进行反硝化作用，但内碳源是通过消耗外碳源合成的[19]，并且内碳源降解速率慢不足以提供反硝化需要的电子[20]. C/N为5时，试验阶段的前3 d反硝化菌主要利用内碳源进行反硝化作用，由于内碳源的降解速率慢使NO3--N去除率降低(见图2)；自第4天开始，内碳源不足以提供反硝化所需碳源，NO3--N出现累积现象；同时，NO3--N得电子的能力弱于O2，缺氧区中兼性微生物首先以O2为电子受体降解有机物[21]，因此当碳源不足时，缺氧区O2消耗速率降低，ρ(DO)升高(见图3)进一步抑制NO3--N的反硝化进程. 以NO2--N为电子受体的短程反硝化比以NO3--N为电子受体的全程反硝化所需的碳源少40.74%[22]，同时AMO和NOR活性的提高(见图6)使更多的NO2--N在好氧区直接转化为NO3--N，所以碳源的减少不会造成NO2--N的积累. 因此可以适当降低好氧区曝气量，在ρ(DO)较低下实现短程硝化反硝化，进而提高低C/N下的TN去除率.

EPS是在一定环境条件下微生物分泌到胞外的高分子聚合物，主要由多糖、蛋白质和核酸等组成[23]. EPS不仅为微生物提供保护层以抵御环境的骤变，也能为饥饿的微生物提供碳源和能量[24]，有助于提高出水水质、降解有机物、减少悬浮颗粒，影响废水生物处理性能[25-26]. C/N对EPS的影响主要体现在蛋白质与多糖含量的变化. 该研究用蛋白质和多糖含量变化表征EPS的变化，C/N由6降为1的过程中，缺氧区EPS含量的明显下降(见图4)是NO3--N的去除受到影响的重要原因；同时，EPS降解产生含氮小分子有机物，是导致出水ρ(TN)比进水高的原因之一. C/N对于EPS的产量有着重要的影响，随着C/N升高，EPS含量呈现逐渐上升的趋势[27]. 胡小兵等[28]对EPS影响活性污泥吸附生活污水碳源的研究发现，EPS含量越大，污泥絮凝体的吸附能力越强，污水污染物的去除率越高. 另外，EPS可被细菌作为碳源利用，当环境中营养物质缺乏时被微生物降解利用，从而缺氧区的EPS含量降低. SMP(溶解性微生物代谢产物)在反应器生物膜EPS中的占比随C/N降低而降低(见表2)，而细胞饥饿时会产生更多SMP[29]，且SMP可被生物降解[30]. NI等[31]认为，在碳源不足时异养菌依赖硝化菌产生的SMP生存，致使其在EPS中占比降低. 进水C/N降低过程中，缺氧区生物膜EPS中腐殖酸类物质占比出现波动，但未减少，好氧区中腐殖酸类物质的占比有增高趋势. 姚璐璐等[13]对城市污水中溶解性有机物去除的研究表明，腐殖酸属于难降解有机物，在反应器中有累积趋势. Ⅰ和Ⅱ荧光区物质属于易生物降解有机物，Ⅲ和Ⅳ荧光区物质为可生物降解有机物，可见A/O-MBBR反应器内生物膜EPS中可以被微生物降解利用的有机物占95%以上，可为反硝化提供必要的碳源.

碳源不足抑制了NR活性，造成海水养殖废水中NO3--N积累，生物反硝化不彻底. 为了实现TN的高效去除，一方面可以适当减少好氧区的曝气量，降低ρ(DO)，形成NO2--N积累，实现短程硝化反硝化过程；另一方面可以在缺氧区中适量补充廉价碳源，如活性污泥发酵产物，以降低碳源不足对反硝化过程的抑制.

4 结论

a) 海水养殖废水中C/N由12降至1的过程中，氨氧化、亚硝酸盐氧化相关酶活性不受影响，NH4+-N、NO2--N去除效果不受影响；而反硝化酶在C/N小于5时受到抑制，NO3--N积累严重.

b) C/N降低过程中，异养反硝化反应电子供体出现由外碳源向内碳源和EPS的转换，但由于内碳源降解速率慢且含量有限，导致相关酶活性随碳源减少而降低.

c) 碳源不足是造成海水养殖废水生物反硝化不彻底的主要原因，可通过降低缺氧区含氧量或补充碳源等方式提高脱氮效果.