扰动方式对太湖藻类胞外多糖浓度的影响

郭亚格, 田 伟, 杨桂军, 张宏亮, 汤祥明

1.中国科学院南京地理与湖泊研究所，湖泊与环境国家重点实验室, 江苏 南京 210008 2.安阳师范学院资源环境与旅游学院, 河南 安阳 455000 3.安徽师范大学环境科学与工程学院, 安徽 芜湖 241003 4.江南大学环境与土木工程学院, 江苏 无锡 214122

随着我国经济的快速发展，大量污染物排入河流和湖泊，导致水体富营养化现象日趋严重. 蓝藻水华是富营养化湖泊的重要表征之一，蓝藻水华频发，已成为我国面临的重大环境问题之一[1-3]. 研究[4]表明，部分蓝藻在生长过程中或外部环境胁迫条件下会分泌大量的EPS (extracellular polysaccharide，胞外多糖)，包括黏附在细胞外的bEPS (bound extracellular polysaccharide，固着性胞外多糖)和释放到周围环境中的sEPS (soluble extracellular polysaccharide，溶解性胞外多糖). 蓝藻EPS在维持生物量庞大的蓝藻生长和增殖中起着重要作用，EPS的释放有利于藻细胞的聚集，聚集成团的藻细胞可以帮助蓝藻抵御外界的不良环境[5]. 研究证明，蓝藻胞外结合的多糖层能帮助其对抗脱水、吞噬作用、抗体识别和病毒的溶菌作用[6-7]，还能使细胞附着在固体基质上以防止被流水冲走[8]. QIN等[9]发现由于EPS的存在，中度或小的风浪扰动会导致藻细胞聚集成更大的群体，从而增加藻团的浮力，加速蓝藻水华的形成.

在自然水体中，当生存状况恶劣时，蓝藻会分泌sEPS和bEPS，细胞表面的EPS层变厚[10]. Yim等[11]研究表明，氮和磷缺乏能够刺激EPS的合成. Staats等[12]研究发现，当藻细胞被接种到低浓度氮或磷培养基时，EPS的分泌会受到激发. 研究[13-14]表明，氮、磷限制在一定程度上可以促进EPS的分泌. 风浪扰动对蓝藻EPS的形成也具有重要作用，水动力扰动会在很大程度上改变水体的理化性质[15-17]，从而影响藻类EPS的分泌. 关于扰动对藻类EPS的影响，国内外学者进行了部分研究[18-19]，但关于不同扰动方式对藻类EPS影响的研究还较少. 芮政等[20]研究表明，间歇扰动组的水华微囊藻EPS含量显著高于不扰动组，其原因可能是扰动作用对微囊藻细胞产生了刺激作用，引起藻细胞生理特征的改变，从而促进了EPS的分泌.

太湖是一个典型的大型浅水湖泊[21]，面积为 2 338 km2，平均水深为1.9 m，最大水深不足3 m[22-23]. 受亚热带季风和台风的影响，尤其是在夏秋季节，风浪扰动使湖水始终处于一个动态环境. 研究[24-25]表明，蓝藻水华的暴发与风浪扰动密切相关. 太湖由风浪引起的扰动属于间歇扰动. 该研究通过模拟试验，对比了间歇扰动、持续扰动和不扰动(对照组)3种方式下太湖藻类ρ(EPS)的差异，并探讨了扰动方式以及相关环境因子对蓝藻EPS的影响，为蓝藻水华暴发机理提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 试验设置和样品采集

1.1.1试验设置

试验在中国科学院太湖湖泊生态系统研究站生态室水池内进行. 以9只洗净晾干的100 L塑料水桶为试验容器. 在太湖边打捞发生水华时的藻类和湖水，蓝藻藻浆用64 μm尼龙网浓缩(经鉴定，蓝藻的比例占85%以上，且微囊藻占蓝藻的绝大部分)，随后添加适量蓝藻藻浆于上述水桶内，混匀后测定水桶中的ρ(Chla)，保持各水桶内ρ(Chla)初始值在110 mg/L左右. 再向桶中加入氮、磷营养盐，使所有水桶中ρ(TN)为10 mg/L，ρ(TP)为0.5 mg/L〔模拟了近10年太湖蓝藻水华暴发最严重的梅梁湾N/P(氮磷比)的平均值，是梅梁湾2000—2008年ρ(TN)、ρ(TP)平均值的4倍，其中TN和TP分别用NaNO3和K2HPO4·3H2O配制〕. 在扰动组6只水桶的水面下10 cm处固定变频造浪泵(中山市捷宝电子电器有限公司，型号为WP-60，功率为60 W)，使用W1经典造浪模式，扰动时获得水平方向的波浪，浪高约5 cm，流量约为330 L/min. 水体静置1 d后开始试验. 试验时，3只水桶不扰动(对照组)；3只水桶每天扰动6 h，时间为10:00—13:00及16:00—19:00(间歇扰动组)；其余3只水桶每天扰动24 h(持续扰动组). 水桶悬挂放在有机玻璃房内的大型水池内，试验持续19 d(2018年7月11—29日).

1.1.2样品采集

试验开始第1、4、7、10、13、16、19天，每天08:00左右采集约1 L水样，用于测定水体中的相关理化参数、ρ(EPS)及藻类相关参数等.

1.2 理化因子分析

试验期间，每天08:30使用多参数水质检测仪(YSI, 6600V2, 美国)测量水温及ρ(DO).ρ(TDN) (TDN为溶解性总氮)、ρ(TDP)(TDP为溶解性总磷)、ρ(Chla)、ρ(SS)(SS为总悬浮物)等水体中理化因子的测定参考《湖泊富营养化调查规范》[26]. 藻细胞密度(algae cell density, ACD)的测定参照李胜男等[27]的方法，利用流式细胞仪(FACSJazz,美国Becton Dickinson公司)进行检测.

1.3 ρ(EPS)测定

ρ(EPS)的测定参照YANG等[10]的方法，将EPS分为bEPS和sEPS进行分别测定. 用移液管取混匀藻液10 mL，冷冻24 h后取出溶解，用超声破碎机高频下破碎15 min，质量配平，然后在4 ℃、11 000 r/min 下离心15 min，分离上清液和藻细胞，然后用移液枪吸取上清液用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，滤液加入透析袋(截留分子量为 3 500 u)置于去离子水中透析，用于测定ρ(sEPS). 上述离心后的藻团加去离子水至10 mL摇匀，再加入0.5 mg/L NaOH溶液调节pH为10，摇匀后置于45 ℃温水水浴提取4 h，然后在4 ℃、11 000 r/min下离心15 min，取上清液用孔径为0.45 μm滤膜过滤后，滤液加入透析袋(截留分子量为 3 500 u)置于去离子水中透析，然后用于测定ρ(bEPS). 把所获得的两种滤液各取出1 mL，加入4 mL蒽酮溶液，沸水水浴10 min，冷却后用分光光度计测量620 nm波长处的吸光值，参照文献[28]中的方法，根据标准曲线计算ρ(bEPS)和ρ(sEPS).ρ(EPS)为ρ(bEPS)与ρ(sEPS)之和.

图1 试验过程中各处理组ρ(EPS)及单位藻细胞EPS含量的变化趋势Fig.1 Changes of extracellular polysaccharide concentration and extracellular polysaccharides content of unit algal cells in each group during the experiment

1.4 数据分析

该研究所有数据通过Microsoft Excel 2016软件录入，采用R 3.5.2和Origin 2018软件进行分析和制图. 因为数据不全是正态分布数据，故使用非参数Kruskal-Wallis秩和检验分析各参数在不同处理下是否存在显著性差异(P<0.05为具有显著性差异).

2 结果与分析

2.1 扰动方式对蓝藻ρ(EPS)的影响

试验过程中对照组、间歇扰动组和持续扰动组的ρ(EPS)总体上均呈上升趋势〔见图1(a)〕. 试验第1～7天，3个处理组的ρ(EPS)没有明显变化；第7～10天，3个处理组的ρ(sEPS)和ρ(bEPS)均明显上升；第10～19天，持续扰动组的ρ(sEPS)和ρ(bEPS)变化趋势与对照组相似，均呈先降后升的趋势. 总体而言，对照组、间歇扰动组和持续扰动组的ρ(EPS)分别由第1天的1.24、1.04和1.24 μg/mL增至第19天的22.01、17.63和25.12 μg/mL，分别增加了约18、17和20倍. 非参数Kruskal-Wallis秩和检验结果表明，试验第1～13天，3个处理组之间的ρ(EPS)差异不显著(P>0.05)；第16～19天，对照组和持续扰动组的ρ(sEPS)均显著高于间歇扰动组(P<0.05)，而3个处理组之间的ρ(bEPS)仍无显著性差异(P>0.05).

扰动会对生物量造成影响，进而影响单位藻细胞EPS含量，因此根据试验不同阶段每mL水体中藻类的细胞数，笔者计算了以μg/(105cells)为单位的EPS含量变化趋势〔见图1(b)〕. 试验期间，3个处理组的单位藻细胞EPS含量在第1～7天无明显变化，第7～19天呈现先升后降的趋势，至第19天对照组、间歇扰动组和持续扰动组的单位藻细胞EPS含量分别为4.63、12.03和22.10 μg/(105cells). 非参数Kruskal-Wallis秩和检验结果表明：第1～7天，3个处理组的单位藻细胞EPS含量差异不显著(P>0.05)；第10～19天，对照组的单位藻细胞EPS、sEPS和bEPS含量均显著低于间歇扰动组和持续扰动组(P<0.05)；至试验结束之时(第19天)，持续扰动组的单位藻细胞sEPS和bEPS含量显著高于间歇扰动组(P<0.05). 该结果表明，扰动尤其是持续扰动能促进蓝藻EPS的分泌.

2.2 试验过程中各处理组ρ(sEPS)和ρ(bEPS)占比的变化

对照组、间歇扰动组和持续扰动组中ρ(sEPS)和ρ(bEPS)在ρ(EPS)中占比及单位藻细胞EPS含量的变化趋势见图2. 非参数Kruskal-Wallis秩和检验结果表明，3个处理组ρ(sEPS)和ρ(bEPS)占比之间无显著差异(P>0.05). 3个处理组的ρ(EPS)在1～7 d均处于较低水平，随后对照组和间歇扰动组的ρ(EPS)在7～13 d呈上升趋势，在13～19 d呈下降趋势，持续扰动组的ρ(EPS)在7～16 d呈上升趋势，在16～19 d有所下降.

图2 对照组、间歇扰动组及持续扰动组的单位藻细胞EPS含量以及ρ(sEPS)和ρ(bEPS)占比随时间的变化Fig.2 Changes in extracellular polysaccharide content of unit algal cells, and the proportions of sEPS and bEPS with time in control group, intermittent disturbance group and continuous disturbance group

试验第1～7天，3个处理组ρ(sEPS)占比较高，而在第10～19天有所下降，但仍高于ρ(bEPS)占比. 其中，对照组ρ(sEPS)占比出现了两次波动，第一次波动(1～10 d)的顶峰为94.9%(第4天)，随后呈现下降趋势，在第10天降至70.4%，第二次波动(10～19 d)的最大值为83.1%(第16天)，之后有所下降，到第19天降至73.0%. 间歇扰动组中，ρ(sEPS)占比在第1～7天较高(87.3%～93.8%)，随后呈现持续下降趋势，到第19天降至76.3%. 持续扰动组中，ρ(sEPS)占比在1～7 d出现了一次小波动，由第1天的86.0%降至第4天的79.0%，随后在第7天增至92.7%，而在第7～19天基本呈下降趋势，到第19天降至67.0%.

2.3 理化因子与ρ(EPS)的相关性

3个处理组ρ(DO)、ρ(TDN)、ρ(TDP)、ρ(Chla)、ρ(SS)和藻细胞密度的变化趋势见图3. 由图3可见：试验期间，对照组、间歇扰动组和持续扰动组的ρ(DO)均有所下降，分别由9.06、9.36和9.78 mg/L降至7.86、3.17和7.49 mg/L，对照组的ρ(DO)在1～4 d呈上升趋势，而间歇扰动组和持续扰动组的ρ(DO)在1～4 d呈下降趋势，随后处于较平稳的状态(4～19 d)，且间歇扰动组的ρ(DO)始终低于其余两组；3个处理组的ρ(TDN)和ρ(TDP)在试验期间均呈下降趋势；3个处理组的ρ(Chla)在试验期间出现了一定幅度的波动，但总体上均呈上升趋势，其中持续扰动组的ρ(Chla)始终高于其余两组；3个处理组的藻细胞密度在试验过程中均出现了较明显的波动，其中第10～19天间歇扰动组和持续扰动组的藻细胞密度均低于对照组；对照组和间歇扰动组的ρ(SS)在1～7 d均呈下降趋势，在7～19 d呈上升趋势，而持续扰动组的ρ(SS)在试验过程中几乎呈持续上升趋势.

图3 试验过程中各组主要理化因子的变化趋势Fig.3 Trends in the main physical and chemical factors in different groups during the experiment

Spearman 相关性分析结果(见表1)表明，ρ(DO)、ρ(TDN)、ρ(TDP)、ρ(Chla)、ρ(SS)和藻细胞密度与3个处理组的单位藻细胞EPS含量均具有一定的相关关系.ρ(DO)与3个处理组的单位藻细胞EPS含量均呈负相关，与对照组相关性最为显著(R=-0.90，P<0.001)，表明在ρ(DO)较低时，蓝藻会分泌较多的EPS.ρ(TDN)、ρ(TDP)与3个处理组的单位藻细胞EPS含量均呈显著负相关，其中，ρ(TDN)与持续扰动组单位藻细胞EPS含量之间的负相关性最强(R=-0.81，P<0.001)，ρ(TDP)与间歇扰动组单位藻细胞sEPS含量之间的负相关性最强(R=-0.80，P<0.001)，表明ρ(TDN)、ρ(TDP)较低时有利于蓝藻EPS的形成.ρ(Chla)、ρ(SS)与3个处理组的单位藻细胞EPS含量均呈正相关，其中，ρ(SS)与持续扰动组的单位藻细胞bEPS含量之间的相关性最强(R=0.71，P<0.001)，表明ρ(Chla)、ρ(SS)较高时能促进蓝藻分泌EPS. 藻细胞密度与3个处理组的单位藻细胞EPS含量均呈负相关，其中，与间歇扰动组的单位藻细胞sEPS含量呈显著负相关(R=-0.88，P<0.001). 综上，理化因子对蓝藻EPS的形成起着非常重要的作用.

表1 理化因子与各处理组水体ρ(EPS)及单位藻细胞EPS含量的相关性

3 讨论

3.1 扰动方式对ρ(EPS)的影响

该研究结果显示，在1～7 d，对照组和扰动组之间的ρ(EPS)无显著差异. 而刘玉等[29]研究发现，连续扰动24 h后，100和200 r/min试验组ρ(EPS)显著高于对照组，50和400 r/min试验组与对照组无显著差异，适度的扰动可以促使藻细胞ρ(sEPS)显著提高. 试验设置的扰动强度大小可能是导致该试验中1～7 d内ρ(EPS)差异不显著的原因之一. 此外，试验过程中收集的太湖藻类在试验大桶中可能都有为期一周的适应期. 在10～19 d，对照组的ρ(EPS)、ρ(sEPS)和ρ(bEPS)均显著低于间歇扰动组和持续扰动组，这可能是经过一段适应期后扰动使藻细胞生理特征逐步改变，促进了EPS的分泌[20]，从而使得两个扰动组单位藻细胞EPS含量较高. 而持续扰动对藻细胞产生的刺激作用更强烈，导致试验结束之时，该组的ρ(EPS)和ρ(bEPS)还显著高于间歇扰动组.

单位藻细胞EPS含量与生长周期密切相关，通常认为，藻类在其生长期内会不断地释放EPS，并且进入静止期后释放量增大. 如图2所示，在1～7 d，3个处理组的单位藻细胞EPS含量没有明显变化，可能是因为在培养初期，藻细胞处于适应期，且此时水体中的氮、磷质量浓度较高，而高浓度的氮、磷营养盐又会抑制藻细胞EPS的分泌[5]，致使单位藻细胞EPS含量较低. 随后3个处理组的单位藻细胞EPS含量均出现大幅上升，可能是因为在试验前期，随着藻类的生长3个处理组的ρ(TDN)、ρ(TDP)均呈下降趋势，使得氮、磷质量浓度在7 d后处于较低状态，而氮、磷质量浓度较低会促使藻类产生EPS[12]. 试验后期3个处理组的单位藻细胞EPS含量呈下降趋势，可能是因为藻在新环境中适应了一段时间后多糖分泌量会减小[30]. 至试验结束之时，3个处理组的单位藻细胞EPS含量均保持在较高水平，浦寅芳等[31]认为，培养时间对EPS产量有显著影响，藻细胞在生长中后期开始积累多糖，所以生长后期的单位藻细胞EPS含量明显高于生长前期.

从EPS形成的角度看，ρ(sEPS)和ρ(bEPS)的占比值得关注. 该试验结果显示，对照组的ρ(sEPS)占比呈现出先升后降的趋势，但第19天和第1天的ρ(sEPS)占比差别不大；而间歇扰动组和持续扰动组的ρ(sEPS)占比在试验过程中分别下降了27%和20%. 这可能是由于扰动刺激改变了藻类EPS在溶解态和固着态之间的分配，其具体机制有待进一步研究.

3.2 理化因子的变化对ρ(EPS)的影响

研究[32]表明，藻类在生长堆积或者衰亡腐烂时会消耗大量DO，使水体产生缺氧甚至厌氧条件，而不利的生长条件是蓝藻大量分泌EPS的主要原因之一[33]，即当水体处于缺氧或厌氧条件时会促使蓝藻分泌较多的EPS，这可能是该研究中ρ(DO)与ρ(EPS)呈负相关的原因之一. 该研究发现，ρ(TDN)、ρ(TDP)与3个处理组的ρ(EPS)均呈负相关，氮、磷浓度较低会导致培养环境中C/N和C/P升高，进而促进蓝藻将多余的碳营养元素合成为EPS分泌到细胞外[34-36]，使得ρ(EPS)上升. 氮、磷限制能显著提高蓝藻碳水化合物的合成，尤其是在氮限制条件下能够激发sEPS和bEPS等碳水化合物组分的提高[37]. Granum等[38]也发现，当氮耗尽时，藻胞外多聚糖的分泌量增加，而极端的氮限制和磷限制会导致藻产生更多的胞外多聚糖. 代晓炫等[39]发现，氮、磷的增加造成了多糖含量的降低，这是因为氮、磷充足时光合作用的产物优先以蛋白质、RNA的形式出现，从而导致多糖含量相对减少，该试验从另一方面证实了氮、磷质量浓度与ρ(EPS)均呈负相关的观点. 这种情况在其他藻类中也有发现，尤珊等[40]发现，低氮条件有利于微藻EPS的积累，氮缺乏导致光合效率降低，微藻对氮饥饿的反应是自身含氮大分子的降解，从而导致细胞氮含量的显著降低和多糖的积累. 该研究表明，水体中DO、氮、磷质量浓度较低时能够促进藻类EPS的分泌.

ρ(Chla)与ρ(EPS)呈正相关，蓝藻细胞通过光合作用合成碳水化合物，然后根据生理活动的需要合成核酸、蛋白质等，单个细胞中多糖的多少实际上取决于多糖与微囊藻细胞内蛋白质、核酸等物质的比例关系[39]，Chla是各门藻类中都含有的光合作用色素，其浓度的升高表明藻类光合作用强烈，合成的蛋白质、核酸等物质增多，从而促使细胞产生更多的EPS. 藻细胞密度与单位藻细胞EPS含量呈显著负相关，有研究[10]表明，单位藻细胞sEPS和bEPS含量受藻生长的影响，藻在生长不利的情况下单位藻细胞sEPS和bEPS含量较大，反之，单位藻细胞sEPS和bEPS含量较小，这是因为当生存状况恶劣时，蓝藻会分泌较多的多糖，以作为胁迫环境下的保护机制，而与此同时藻细胞密度会有所下降，因而导致二者呈负相关.

蓝藻EPS的分泌本质上是生物应对外界不利环境因素的一种反应，这种聚集可能是一种防止被捕食的策略[41]. 此外，当氮、磷营养盐等环境因素呈现不利状态时，会诱使蓝藻EPS分泌增加，供给藻际微生物以碳源，并通过藻际细菌或真菌等的矿化作用获得氮、磷营养盐[42-43]，这种藻菌互利合作对藻类EPS的分泌需要进一步研究.

4 结论

a) 第1～7天，扰动对ρ(EPS)、ρ(sEPS)和ρ(bEPS)的影响不显著(P>0.05)；但是第10～19天，对照组的ρ(EPS)、ρ(sEPS)和ρ(bEPS)均显著低于间歇扰动组和持续扰动组(P<0.05)；第19天，持续扰动组的ρ(sEPS)和ρ(bEPS)显著高于间歇扰动组(P<0.05)，表明扰动尤其是持续扰动能在一定程度上促进EPS的分泌.

b) 水体中氮、磷和DO质量浓度及藻细胞密度较低时能够促进蓝藻EPS的分泌，反之，则会抑制蓝藻EPS的分泌.

c) 水体中ρ(Chla)和ρ(SS)较高时能够促进EPS的分泌，且理化因子对蓝藻EPS的形成起着非常重要的作用.