粒细胞集落刺激因子对IVF-ET拮抗剂方案鲜胚移植妊娠结局的影响

茹慧波，董九华，王琇，张亦心，杜丽荣

(河北省计划生育科学技术研究院 国家卫生健康委员会计划生育与优生重点实验室 河北省生殖医学重点实验室，石家庄 050071)

促性腺激素释放激素拮抗剂方案(拮抗剂方案)在辅助生殖技术(ART)的临床实践中以其周期治疗时间短、符合生理过程的优势在控制性促排卵中受到重视[1]。虽然有Meta分析认为拮抗剂方案与激动剂长方案的妊娠结局基本一致，但还有不少研究认为两者间存在一定差异[2]。近年临床实践中发现拮抗剂方案新鲜周期移植的着床率和妊娠率均低于激动剂方案[3]，因此临床上准备鲜胚移植的患者会避免采用拮抗剂方案，而采用拮抗剂方案促排卵的患者往往会行全胚冷冻后再解冻移植。研究证实，当获卵数小于15枚时，全胚冷冻后解冻移植的临床结局并不优于新鲜周期移植[4]。此外，实施全胚冷冻+冻融胚胎移植(FET)不仅延长了患者获得妊娠的时间，增加患者的焦虑情绪，而且增加了FET周期的经济费用。因此，如何提高拮抗剂方案鲜胚移植妊娠率是现在研究热点之一。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是正常妊娠生理过程中调节子宫内膜免疫细胞功能的重要细胞因子之一，在母胎界面有着重要的调节作用。研究已证明G-CSF可参与调节子宫内膜血管重塑、局部免疫调控及细胞粘附系统，调节子宫内膜容受性，包括子宫内膜厚度、腔上皮、腺上皮、间质的发育状态及子宫内膜的血流灌注情况[5]。研究发现G-CSF可以提高反复移植失败IVF患者的妊娠率[6]。本研究旨在探讨拮抗剂方案鲜胚移植患者移植时使用G-CSF能否改善其妊娠结局。

资料及方法

一、研究对象及分组

本研究经河北省计划生育科学技术研究院伦理委员会审批通过后，招募2018年1月至2019年10月于我院采用拮抗剂方案行IVF-ET治疗的患者，严格按照纳入和排除标准筛选，经与患者充分沟通讨论实验对妊娠率的影响和药物可能的副作用等，患者夫妇知情同意并签署相关知情同意书后，采用完全随机分组研究的方法和要求，按照SPSS软件提供的完全随机数字表，遵循完全随机原则分配为治疗组和对照组，每组各50例。

纳入标准：20～40岁不孕患者；促排卵方案为拮抗剂方案；新鲜周期移植。

排除标准：对G-CSF过敏者以及对大肠杆菌表达的其他制剂过敏者；既往恶性肿瘤、血液系统疾病病史者，尤其是骨髓中幼稚粒细胞未显著减少的骨髓性白血病或外周血中检出幼稚粒细胞的骨髓性白血病。

二、研究方法

1.辅助生殖治疗：采用灵活GnRH拮抗剂方案促排卵，于月经第2～3天进周期，促性腺激素(Gn)初始量依年龄、基础激素水平、基础窦卵泡数、抗苗勒管激素(AMH)水平、体重指数(BMI)及既往促排结局等综合评价，启动量为150～300 U/d，视卵泡发育情况及血FSH、LH、E2、P水平及时调整Gn的用量和卵泡监测时间；B超监测发现有1个以上卵泡直径达到14 mm或者LH≥4 U/L或者E2≥1 500 pmol/L时开始加用注射用醋酸西曲瑞克(思则凯，默克雪兰诺，法国)0.125～0.25 mg，直至扳机日。当1～2个主导卵泡平均直径≥18～20 mm或>16 mm主导卵泡占比大于60%时，使用重组HCG(艾泽，默克雪兰诺，西班牙)250 μg 联合HCG(珠海丽珠医药)2 000～5 000 U扳机，36 h后经阴道超声引导下穿刺取卵。移植前行胚胎质量评分，按照胚胎标准评分选取1～2枚第3天卵裂期胚胎进行移植，且至少1枚为优质胚胎。优质胚胎根据人类体外受精-胚胎移植实验室操作专家共识中[7]定义为I级、II级胚胎。

2.对照组用药：移植后常规黄体支持，阴道用黄体酮阴道缓释凝胶(雪诺同，默克雪兰诺，英国)90 mg，每天一次；芬吗通(雅培，荷兰)黄片(2 mg/片)1片，口服，每日2次。

3.治疗组用药：移植日开始给予G-CSF注射液(吉赛欣，华北制药汉坦生物技术)150 μg，皮下注射，隔日一次，共注射5次，并随访观察用药期间有无不良反应。其余用药同对照组常规黄体支持。

4.妊娠结局判断：移植14 d测血β-HCG>5 U/L为HCG阳性；HCG阳性但经阴道B超于宫内及宫外均未探及明显孕囊或期间月经来潮，复查HCG值下降或转阴诊断为生化妊娠；阴道超声探及孕囊，或者流产组织病理检查提示为绒毛组织者诊断为临床妊娠。临床妊娠者记录孕囊个数和妊娠结局。

三、观察指标及判定标准

两组患者一般资料(年龄、不孕年限、不孕类型、既往助孕周期数、BMI、基础激素水平)；促排卵情况(Gn天数、Gn用量、获卵数、MⅡ卵数)；胚胎培养情况(受精率、正常受精率、可利用胚胎数、优胚数)；胚胎移植情况及妊娠结局(子宫内膜厚度/分型/血流、移植胚胎数、移植优胚数、HCG阳性率、临床妊娠率、早期流产率、胚胎种植率)。

胚胎种植率=总孕囊数/移植总胚胎数；HCG阳性率=HCG阳性例数/总移植周期数；临床妊娠率=临床妊娠例数/总移植周期数；流产率=流产人数/临床妊娠人数。

四、统计学分析

结 果

一、患者一般情况比较

随机入组患者每组各50例，因内膜因素、胚胎因素、患者意愿等原因取消移植17例，最终将治疗组41例、对照组42例相关数据纳入统计分析。两组患者间年龄、不孕年限、基础激素水平等一般情况比较均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者一般情况比较[(-±s)，n(%)]

二、患者IVF-ET情况比较

1.促排卵、受精及胚胎培养情况比较：两组患者间Gn天数/用量、获卵数等比较均无统计学差异(P>0.05)；两组间正常受精率、可利用胚胎数及优胚数比较亦无统计学差异(P>0.05)(表2)。

2.移植前子宫内膜情况比较：两组患者间移植前子宫内膜厚度、分型、血流比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表2 两组患者促排卵、受精及胚胎培养情况比较[(-±s)，%]

表3 两组患者移植前子宫内膜情况比较[(-±s)，n(%)]

3.胚胎移植及妊娠结局比较：两组患者间移植胚胎数目、移植优胚数等比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；G-CSF治疗组HCG阳性率、临床妊娠率、胚胎种植率均显著高于对照组(P<0.05)，但两组间早期流产率比较差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。

三、两组患者胚胎移植14 d时β-HCG水平比较

两组患者移植14 d时β-HCG水平比较，两组HCG阳性者β-HCG水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，临床妊娠者亦然(P>0.05)。考虑到单胎与双胎分泌β-HCG差异，两组单胎妊娠者β-HCG水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，双胎妊娠者亦然(P>0.05)(表5)。

表4 两组患者胚胎移植及妊娠结局比较[(-±s)，%]

表5 两组患者胚胎移植14 d时不同妊娠结局者β-HCG水平比较(-±s)

四、不良反应

治疗组中发现15例使用G-CSF后白细胞轻度升高(后复查正常)、1例失眠，未发现其他不良反应(如发热、头痛、皮肤异常和肝肾功异常等)以及严重不良反应。

讨 论

辅助生殖技术(ART)在不孕症患者中的运用日趋完善，控制性促排卵的方法也在摸索中前进。促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)长方案是经典的鲜胚移植的促排卵方案，妊娠率稳定，但是存在周期时间长、容易发生卵巢过度刺激综合征(OHSS)等缺点，于是GnRH拮抗剂方案在临床实践中应运而生，并以其周期治疗时间短、更加符合生理过程的优势在控制性促排卵中占有越来越重要的地位。Grow等[8]回顾性分析ART中卵巢正常反应患者，发现拮抗剂方案与长方案患者相比，子宫内膜容受性较差、种植率和活产率较低。陈峥屹等[9]认为拮抗剂具有溶黄体作用，导致拮抗剂方案中存在黄体功能不足的情况，影响妊娠结局。其他研究也发现拮抗剂方案胚胎着床率低于GnRH-a长方案，并认为拮抗剂可能影响子宫内膜容受性而使胚胎着床率降低[2-3]。李宣等[1]等认为过低的LH水平可能与拮抗剂对内源性LH的过度抑制有关，从而通过影响子宫内膜容受性等环节，进一步影响临床妊娠结局，而合理控制HCG日LH水平可能有利于拮抗剂方案鲜胚移植临床结局。由此可见拮抗剂方案鲜胚移植妊娠率下降备受临床医生的关注。

对于如何改善拮抗剂方案的妊娠结局，生殖医生也进行了大量研究工作。Copperman等[10]认为反向添加重组人LH(rLH)可对抗大剂量拮抗剂引起的LH耗竭，从而提高妊娠率。徐蓓等[11]研究表明拮抗剂方案不宜延迟扳机，尤其对于如Gn使用时间较长或孕酮水平高于1 ng/ml(3.17 nmol/L)时，以防扳机时机后延致内膜发育不同步，从而影响妊娠结局。对于拮抗剂方案鲜胚移植患者，是否需要加强黄体支持及如何进行黄体支持尚无定论，常用方法为加强补充雌/孕激素和双扳机或取卵日添加HCG，而GnRH-a作为新型的黄体支持药物仍存在争议。如何提高拮抗剂方案鲜胚移植的妊娠率有待进一步研究。

目前生殖免疫学是生殖领域新的交叉学科与研究热点。G-CSF于1983年首次在小鼠体内发现，其为一种分子量约为2万的糖蛋白，属于骨髓造血细胞的增殖因子，可以广泛作用于骨髓微环境，其受体在多种髓系细胞表面均有表达，还可见于内皮细胞、胎盘细胞、滋养细胞、胎母细胞界面和颗粒黄体化细胞等[12-14]。胚胎种植是个复杂的过程，免疫细胞在子宫内膜容受性中发挥着重要作用，成功植入及妊娠需要免疫平衡[15]。学者认为G-CSF在窗口植入期可抑制机体对胚胎发动的免疫攻击，使子宫内膜具有足够的容受性帮助胚胎着床[16]。G-CSF还可以通过增加白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β等趋化因子的分泌，诱导Th-2免疫应答，参与胚胎着床期间子宫内膜的成熟[17]。徐士儒等[18]发现拮抗剂方案可显著上调子宫内膜各免疫细胞的阳性细胞率，提示免疫细胞可能影响子宫内膜容受性。

临床研究方面，Aleyasin等[6]在一项多中心随机对照试验中评价全身单剂量皮下G-CSF给药对不孕女性IVF-ET成功率的影响，干预组在胚胎移植前1 h皮下注射G-CSF 300 μg，发现该方法显著增加反复种植失败(RIF)患者的妊娠率。Zhang等[19]的Meta分析发现G-CSF通过局部宫腔灌注与皮下注射两种途径对胚胎移植的临床结局有着积极的影响。既往众多研究通过宫腔灌注G-CSF改善子宫内膜容受性，治疗薄型子宫内膜，提高胚胎植入率与临床妊娠率[20-21]。由此可见，通过局部宫腔灌注与皮下注射两种方法均可对胚胎移植的妊娠结局产生影响，鉴于鲜胚移植周期不适宜宫腔灌注的方法，本中心采用移植后皮下注射G-CSF，统计分析发现G-CSF治疗组HCG阳性率、临床妊娠率及胚胎种植率显著优于对照组，与既往研究结果相一致。我们进一步将对照组与治疗组妊娠后不同妊娠状态下的血清β-HCG水平进行比较，探索G-CSF是否可通过生化学指标来反应滋养细胞的功能变化，结果发现两组间HCG阳性者、临床妊娠者、单胎妊娠者、双胎妊娠者的移植后14 d血清β-HCG水平均无统计学差异。需要进一步寻找其它指标来验证G-CSF改善妊娠结局的途径。

G-CSF在IVF-ET拮抗剂方案鲜胚移植过程中使用，可以改善妊娠结局。该方法可为临床提高拮抗剂方案鲜胚移植妊娠率提供新思路，但其作用机制尚需进一步研究。G-CSF对子宫内膜蜕膜化的调节可能是通过G-CSF数量的改变来控制不同类型的分泌细胞数量，从而使内膜分泌的各种生物活性因子达到更利于胚胎植入的状态[22]，进而达到改善妊娠结局的作用。但本研究缺乏相关指标的测定来验证猜想，后期的研究设计应同时测定血清细胞因子，以进一步确定其作用机制。此外本研究样本量偏少，将来应设计大样本或多中心的临床研究来避免因样本量造成的结果偏倚。